临床意义未明遗传变异（VUS）在临床实践和研究中的挑战与应对策略

临床意义未明遗传变异（VUS）在临床实践和研究中的挑战与应对策略

  • 9:34 上午

 

摘要

        尽管测序技术和变异解读框架不断进步，遗传检测发现的许多变异，尤其是错义变异，仍被归类为临床意义未明变异（variants of uncertain significance，VUS），持续给疾病诊断和临床管理带来挑战。本综述探讨临床基因组学中VUS解读面临的持续性困难，以及VUS对患者、临床医生和医疗卫生系统的影响。文章总结了有助于解决VUS问题的成熟策略，包括大规模人群参考数据库、数据共享倡议、计算预测工具、基于共识的指南、深度表型分析和功能验证实验。在此基础上，文章重点介绍利用多组学分析、高通量实验平台（例如饱和基因组编辑和基于细胞的形态学检测）以及人工智能驱动工具的新兴方法，以提高变异解读的可扩展性和准确性。这些互补性方法旨在减少不确定性、提高诊断率，并增强基因组检测在研究和精准医学中的临床实用性。

 

背景

        全球罕见病患者超过3亿人[1]，其中美国超过3,000万人[2]。在Orphanet数据库收录的6,000多种罕见病中，约72%具有遗传病因，70%在儿童期发病[1]。孟德尔遗传病与先天性畸形合计影响美国约280万名儿童，是美国婴儿死亡的主要原因[3,4]。一项分析超过1,300万名儿童医疗数据的研究显示，在全部儿科人群中，9%存在与遗传病相符的临床特征；在危重症婴儿中，这一比例为45%[5]。

        为应对这些疾病带来的诊断挑战，外显子组测序和全基因组测序（exome and genome sequencing，ES/GS）等基因组测序技术越来越多地应用于临床和研究场景[6,7]。这些技术促成了超过5,000种已知人类遗传病和超过7,000种具有明确分子基础的表型的发现[8,9]（图1）。

        诊断率、临床实用性和成本效益的提高，使基因检测在许多医疗卫生系统中得到常规应用[10]。然而，随着数百万人的基因组数据不断积累，如何解读临床意义未明变异（VUS）已成为最迫切的挑战之一。有较为大胆的预测认为，到2030年所有VUS都可能得到解决[11]。

本综述介绍目前用于应对这一挑战的策略和正在出现的方法，并强调需要具有可扩展性、可解释性和临床适用性的解决方案，以解决VUS问题并提高基因组检测的实用价值。

        应对这一挑战的关键步骤，是准确判断某一遗传变异是否参与疾病发生；这需要同时评估基因—疾病关系以及该变异潜在的致病性[12]。目前已经建立了多个框架，用于标准化这一过程并提高变异解读的一致性[13–15]。

 

基因—疾病关系的整理与评估

        在有把握地对某个变异进行分类之前，必须先确定该变异所在基因是否与目标疾病存在有效且具有临床意义的关联。为满足这一需求，临床基因组资源（Clinical Genome Resource，ClinGen）于2017年建立了一个基于证据的框架，用于评估基因—疾病关联的临床有效性[17]。该框架采用半定量评分体系评价遗传学证据和实验性证据，并给出定性分类：确定（Definitive）、强（Strong）、中等（Moderate）、有限（Limited）、无已知疾病关系（No Known Disease Relationship）或证据冲突（Conflicting Evidence）。这一标准化工作提高了基因关系整理在研究和临床实践中的可靠性。

        截至2025年12月，ClinGen已完成3,380项基因—疾病关系整理，其中2,120项被归为“确定”，81项为“强”，404项为“中等”，491项为“有限”，53项为“无已知疾病关系”，187项为“有争议”，44项为“已否定”（图1）。随着新证据出现，临床有效性为“中等”或“有限”的基因可能被升级或降级。

        图1. 左图：具有导致罕见单基因疾病的变异的基因累计发现数量（根据OMIM数据改编，网址：https://www.omim.org/statistics/paceGraph）。时间轴标出了包括ACMG指南和人群参考基因组在内的关键进展；这些进展使人类基因组中致病变异的发现和分类成为可能。时间轴上突出显示了重要里程碑。右图：ClinGen基因—疾病关系整理情况（查询日期：2025年12月31日）。堆叠柱状图表示已整理的基因—疾病关系总数，并按照ClinGen有效性分类分层显示：确定和强、中等、有限、无证据，以及有争议和已否定。深蓝色部分中的数字表示“确定”和“强”级整理的累计数量；每个柱右侧的数字表示基因—疾病关系整理的累计总数。VUS，临床意义未明变异；ACMG，美国医学遗传学与基因组学学会；AMP，美国分子病理学协会；CAP，美国病理学家学会；SVC，序列变异整理；ExAC，外显子组聚合联盟；gnomAD，基因组聚合数据库；OMIM，人类孟德尔遗传在线数据库。

        根据即将发布的ACMG/AMP/CAP/ClinGen序列变异分类（Sequence Variant Curation，SVC）4.0版指南，对于临床有效性为“中等”的基因，其变异可能可以报告至“可能致病”；而对于临床有效性为“有限”的基因，由于支持基因—疾病有效性的证据不足，通常不适合进行变异分类。

        全球有多个组织参与基因—疾病关联整理，包括人类孟德尔遗传在线数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、Orphanet、PanelApp平台和Gene2Phenotype等资源[18,19]。这些组织在全球基因整理联盟（Global Gene Curation Coalition）框架下开展合作，以协调全球标准并处理不同资源之间的不一致[20,21]。

 

遗传变异的整理与分类

        对于疾病关联证据至少达到“中等”水平的基因，美国医学遗传学与基因组学学会/分子病理学协会（American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP）指南被广泛用于变异分类。

        相反，对于疾病关联证据有限、已否定、有争议或无已知疾病关系的基因，不建议应用ACMG/AMP框架。

        这些变异整理指南最初于2000年发表[22]，并于2007年和2015年修订[23,13]（图1），引入了标准化术语：“致病”“可能致病”“临床意义未明”“可能良性”和“良性”。变异分类由结构化框架指导，整合多种证据类型，包括人群等位基因频率、等位基因共分离模式、既往受累个体病例报告、变异影响预测以及功能研究。

        ACMG/AMP变异整理体系包括致病证据类别：极强（Very Strong，PVS1）、强（Strong，PS1–PS4）、中等（Moderate，PM1–PM6）和支持（Supporting，PP1–PP5）；以及良性证据类别：独立（Stand-alone，BA1）、强（BS1–BS4）和支持（BP1–BP7）[13]。

        需要特别注意的是，所有证据标准都具有动态性，并且可以进行调整。例如，虽然2015年指南将PM2定义为中等证据[13]，但该证据目前最常以支持强度应用[12]。同样，计算机模拟证据（PP3）可以加权至强证据[24]；功能证据（PS3）的强度则可以从支持到强不等，而不是一律按强证据应用[25]。

        尽管ACMG/AMP指南具有奠基性作用，但其实际应用往往较为复杂。许多标准仍存在解释空间，导致不同实验室之间出现不一致。为应对这些挑战，研究者提出了一系列关于如何应用这些标准的细化方案[14,26,27]（见clinicalgenome.org/tools/clingen-variant-classification-guidance），其中包括ClinGen序列变异解读工作组的重要贡献[28]。这些细化方案旨在提高变异分类的一致性、透明度和可重复性。此外，几十个专家组正在制定基因特异性和变异特异性的细化规则，以增强ACMG/AMP标准的实用性[13,23,29,30]。与此同时，ClinGen序列变异实验室间差异解决工作组与各个变异整理专家组（Variant Curation Expert Panels，VCEPs）继续识别并解决不同实验室之间的分类差异[31–33]。

 

临床意义未明变异

        随着遗传测序技术的发展，VUS这一概念在20世纪90年代首次出现；但直到ACMG于2000年发布建议后，该术语才正式用于临床报告[22]。随着疾病相关变异目录不断扩大，VUS的比例迅速增加。根据ClinVar数据，VUS占比已从2013年的8.2%（11,595个提交变异中的951个）上升到2025年的53.4%（3,971,349个变异中的2,120,759个）（图2A）。

        图2. VUS数量随时间的增长，以及ClinVar中独特VUS数量最多的前30个基因。（A）ClinVar变异分布随时间的变化（查询日期：2025年12月31日）。（B）截至2025年ClinVar变异的统计，包括变异分类和变异类型分布。VUS占全部变异的53.4%，其中错义变异占所有VUS的90.2%（约190万个）。（C）前30个基因中独特VUS数量的柱状图；折线表示VUS累计数量占全部VUS的比例。TTN的VUS数量最多，占0.53%（11,885个）；前30个基因合计占全部VUS的5.4%。（D）前30个基因的KEGG通路分析显示，这些基因参与癌症/错配修复相关通路（46%）、癌症/范可尼贫血相关通路（17%）以及心肌病/骨骼肌相关通路（19%）。P，致病；LP，可能致病；VUS，临床意义未明变异；LB，可能良性；B，良性；UTR，非翻译区；M，百万；SNV，单核苷酸变异。

        根据定义，VUS的致病性后验概率介于0.1和0.9之间[30]，因此其临床意义仍不确定。虽然基因组测序使许多患者能够获得分子诊断，但仍有相当一部分患者只能得到VUS结果。例如，一项近期研究纳入了超过160万名受检者，其中98.3%主要接受多基因Panel（multi-gene panel，MGP）检测；41%的受检者至少有一个VUS，32%的受检者仅获得VUS结果。在这些VUS中，87%为错义变异[34]。

        随着MGP规模不断扩大、基因—疾病关联清单不断延长，以及外显子组测序和基因组测序的广泛使用，VUS负担进一步加重。截至2025年12月，ClinVar收录约400万个变异，其中超过一半（53.4%）为VUS（图2B）。

        绝大多数VUS（90.2%）为错义变异；按VUS数量计排名前30位的基因（如TTN、APC、ATM、NF1等）约占所有报告VUS的5.4%（图2C）。KEGG通路分析显示，这30个基因主要参与癌症/错配修复相关通路（46%）、癌症/范可尼贫血相关疾病（17%）以及心肌病/骨骼肌疾病相关通路（19%）（图2D）。

        为更深入了解VUS的分类情况，研究者分析了从ClinGen证据库获取的ClinGen整理变异数据集；该数据集于2026年1月19日获取，并获得美国食品药品监督管理局认可[16]。在166个疾病相关基因的12,006个已整理变异中，3,822个（32%）被分类为VUS。对于这些VUS，最常使用的ACMG标准包括：PM2（34.8%，在对照人群中缺失）、PP3（16.1%，提示有害效应的计算证据）和BP4（10.6%，提示无影响的计算证据）（图3A）。

        图3. VUS的专家分类及应对VUS的解决方案。（A）ClinGen整理的3,822个VUS汇总（查询日期：2026年1月19日；网址：https://erepo.clinicalgenome.org/evrepo/）。（B）解决 VUS的成熟策略和新兴策略示意图，包括人群数据库、数据共享、计算机模拟预测、整理框架、深度表型分析、多组学整合、高通量实验平台和AI驱动方法。VUS，临床意义未明变异；AI，人工智能；MAVEs，变异效应多重检测；SGE，饱和基因组编辑

        有趣的是，VUS分类率会因检测方式不同而变化。一项近期分析纳入了19家北美临床实验室超过150万份遗传检测结果，发现由VUS导致的非结论性结果在ES/GS中显著低于MGP：ES/GS为23%，MGP为33%[35]。这种差异可能与报告实践有关：实验室往往报告Panel检测发现的全部VUS，但会选择性地报告ES/GS发现的VUS。虽然ES/GS总体上能检测到更多VUS，但通常只根据临床相关性、共分离情况和证据强度，选择其中一部分进行报告。同一研究还显示，基于三人家系的检测，即对先证者及其双亲进行测序，可通过提供共分离证据降低VUS率：三人组检测的VUS率为19%，而非三人组检测为28%[35]。共分离信息包括确认变异是否为新发变异，或确认隐性疾病中的两个变异是否处于反式。这些发现提示，有必要更新当前的实验室实践和报告标准。然而，VUS的影响远不止实验室层面；在临床环境中，如何解读和沟通VUS会显著影响患者照护。

 

患者和医生对VUS结果的体验

        鉴于VUS在临床遗传检测中的高发生率，患者咨询不仅应讨论其医学意义，也应涉及这类不确定结果可能带来的心理和社会影响。检测前咨询应纳入获得非结论性结果的可能性，使患者能够形成透明且基于证据的预期[36]。对患者体验的研究显示，人们对VUS结果的反应多种多样：有些患者将VUS视为未来重新分类和获得诊断的希望来源；另一些患者则感到困惑、焦虑和后悔。这些情绪往往源于VUS结果的模糊性，以及结果本身缺乏可采取行动的指导[36]。

        负责向患者反馈遗传检测结果的临床医生，在VUS的解读和沟通中发挥着关键作用[37]。临床医生通常能够获取实验室解读临床测序结果的人员无法获得的患者数据[38]。临床医生可以使用正交数据，例如蛋白功能的生化检测；这些数据有助于解读VUS对蛋白功能的影响[39]。除标准化实验室报告外，临床医生还会整合患者特异性的临床背景，包括详细表型、家族史以及不断更新的临床信息，以评估VUS的潜在相关性。无论是通过体格检查、阶段性病史采集还是重复影像学检查，连续评估都可能进一步明确患者表型[40]。即使分子层面的解读仍然不确定，这种细致的临床方法也可能帮助医生支持或否定某一诊断[41]。例如，一项近期研究发现，在回报检测结果的咨询过程中，医生将4%的VUS（165个VUS中的6个）解读为分子诊断[42]。这些决定反映出，遗传结果沟通需要个体化，不仅要考虑技术数据，还要考虑患者的目标、价值观和理解程度。

        随着基因组检测越来越容易获得，未接受遗传学专门训练的医学专业人员越来越多地需要回答患者及其家属关于VUS的问题。然而，由于指南不断更新且复杂，而这些临床医生的遗传学知识有限，解读VUS尤其困难。一项利用假设病例评估医生VUS解读能力的研究显示，接近一半的医生无法正确解释VUS的定义[43]。其中部分障碍可以通过由主题专家制作定制化解读报告来克服；这类报告应包含致病性证据的详细说明、对管理的影响，以及后续安排，包括重新分析和研究机会[44,45]。尽管如此，关于VUS结果是否以及在什么情况下应影响临床管理决策，仍存在重要问题[46]。

 

目前解决VUS的方法

        过去十年中，群体遗传学、数据共享、计算预测、变异整理、深度表型分析、变异重新分析以及功能验证方面的进展，对于解决VUS至关重要。以下各节将介绍这些策略及其贡献（图3B）。

群体遗传学

        大规模人群数据库，例如基因组聚合数据库（Genome Aggregation Database，gnomAD）[47]，汇总并协调来自众多大型测序项目的外显子组和基因组测序数据，对解决VUS发挥了重要作用。其早期版本于2014年以外显子组聚合联盟（Exome Aggregation Consortium，ExAC）的形式发布[48]，之后扩展为同时包含外显子组和基因组数据的gnomAD。gnomAD最新版本v4.1.0包含730,947个外显子组和76,215个基因组。

        gnomAD是变异解读的重要资源之一，可提供人群等位基因频率和基因层面的约束信息。例如，次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）>5%的变异通常符合良性独立证据标准BA1；但是，某些高频变异仍可能存在支持其致病性的证据。ClinGen在2018年对BA1的应用进行了更新，明确了适用的人群数据集、相关假设和例外情况[49]，从而提高良性分类的可靠性，同时也允许针对不同基因调整阈值。一项近期研究发现，在纳入gnomAD v4.1.0和All of Us人群参考数据后，近五分之一的VUS（173个中的34个，19.6%）不再符合报告条件；后者提供了更详细的表型信息，可以与受累个体进行更精确的比较[50]。

        目前大规模人群数据库的主要问题之一，是非欧洲人群代表性不足，这可能导致变异误分类[51]。TNNT2 c.571-1G>A变异就是一个例子：该变异最初被报告为VUS，但在大洋洲血统个体中发现其等位基因频率较高后，重新分类为良性[52]。这一案例说明，提高基因组数据库中的祖源多样性，对于避免诊断差异和改善变异解读非常重要。

        除等位基因频率外，gnomAD还提供基因约束指标，例如功能缺失不耐受概率（probability of loss-of-function intolerance，pLI）、功能缺失观察值/期望值上限比例（loss-of-function observed/expected upper bound fraction，LOEUF）[47]以及错义变异Z评分[53]；这些指标反映基因对功能缺失变异或错义变异的耐受程度。位于pLI较高或错义变异约束程度较高的基因中的VUS，或者位于LOEUF较低基因中的VUS，可能提示潜在致病性。

        一项大规模研究利用21–31个氨基酸的滑动窗口分析了822,000个外显子组。在865,269个ClinVar错义VUS中，5,079个（0.68%）位于约束程度最高的前1%区域，17,500个（2%）位于约束程度最高的前15%区域[54]。为进一步提高分辨率，研究者开发了同源错义约束（homologous missense constraint，HMC）评分[55]。HMC利用gnomAD数据，在同源蛋白结构域中以单个氨基酸为单位量化错义变异不耐受性。该方法的表现优于基因层面和区域层面的约束指标，并且可为ACMG/AMP的PP2标准提供有力的补充支持；PP2用于支持以下情况的致病性：某基因良性错义变异发生率较低，且错义变异是该基因相关疾病的常见致病机制[55]。

数据共享

        ClinVar[56]、人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）[57]和Leiden开放变异数据库（Leiden Open Variation Database，LOVD）[58]等数据共享平台，对于整理和传播由世界各地临床实验室、研究人员和临床医生提供的变异信息至关重要。ClinVar由美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）维护，是一个公共数据库，能够存档并比较不同的变异解读，使用户可以识别分类差异并追踪变异随时间发生的重新分类。HGMD提供从已发表文献中提取、经人工整理的疾病相关突变条目，为研究和诊断工作提供支持。LOVD则以基因座特异性数据库为重点，与这些资源互为补充，有助于对单个基因的变异进行详细整理。

        这些资源具有协作性并持续更新，从而提高了变异解读的准确性和临床相关性。通过收集不同来源的证据，它们有助于解决相互冲突的分类结果，并支持重新分析工作。重要的是，这些数据库不仅有助于重新解读VUS，也为验证计算机模拟工具和功能实验提供基础，并为支持或反对变异致病性的判断提供进一步证据。

        对于临床医生而言，这些资源提供了最新的分类结果及其支持数据，即使初始遗传检测结果不能得出明确结论，也可以为诊断决策、风险评估和遗传咨询提供参考。

计算预测

        计算预测工具，即计算机模拟预测，常用于评估遗传变异对蛋白质结构和功能的潜在影响；此类工具近年来快速发展，以改善对VUS致病性的预测。早期工具包括多态性表型预测（Polymorphism Phenotyping，PolyPhen）和从耐受性中筛选不耐受性（Sorting Intolerant From Tolerant，SIFT）[59]；此后又发展出CADD（combined annotation-dependent depletion）[60]和REVEL（rare exome variant ensemble learner）[61]等元预测工具。尽管许多计算机模拟工具采用相似的输入特征，例如保守性评分、生化性质和结构背景，但多个预测工具联合使用时可能产生不一致结果，从而增加VUS解读的复杂性[62]。

        根据2015年ACMG/AMP指南，只有在多个计算工具给出一致预测时，才可以应用计算证据：PP3用于支持致病性，BP4用于支持良性[13]。然而，这种基于多个工具的定性方法会导致不同实验室之间出现差异和主观解释。为解决这一限制，一项研究采用ACMG/AMP框架的贝叶斯改良方法，对13种错义变异计算工具进行了定量校准[63]。此后，REVEL等元预测工具因其一致性和可靠性而得到广泛应用[62]。近年来开发的AlphaMissense、进化尺度建模-1b（evolutionary scale modeling-1b，ESM1b）和VARITY等工具，也已经按照ACMG/AMP解读框架进行校准，使PP3证据可以从支持强度加权至强强度[24]。

        具体而言，AlphaMissense的分值范围为：支持0.792–0.905，中等0.906–0.971，强≥0.990；ESM1b为：支持−12.1至−10.7，中等−13.9至−12.2，强≤−24.0；VARITY为：支持0.675–0.841，中等0.842–0.914，强≥0.965。这些工具的表现与此前推荐的4种计算机模拟预测工具相当[24,64]。不过，计算机模拟预测只是多因素分类框架中的一个组成部分，应在这一范围内进行解释。

变异整理指南

        为了提高变异解读的一致性、准确性和透明度，ClinGen建立了由不同领域专家组支持的标准化整理框架。这些专家组负责同时评估基因—疾病关系和变异致病性，提供经过严格整理的证据，为临床决策提供依据。截至2026年，ClinGen已建立136个专家组，包括59个基因整理专家组（Gene Curation Expert Panels，GCEPs）和77个变异整理专家组（VCEPs），并公开提供用于变异分类的标准规范（cspec.genome.network/cspec/ui/svi）。这些专家组覆盖至少18个临床领域，包括先天性代谢异常、心血管疾病和遗传性肿瘤。例如，ClinGen VCEP已经对23个基因的变异谱和注释进行了整理，并为如何在变异解读中应用PP2等基因约束指标提供了基因特异性指导[12]。

        在专家驱动的变异整理工作之外，研究者也正在进一步细化VUS的分类和沟通方式。一些机构根据现有证据，使用内部指南将VUS分为不同的亚类[15,65,66]。即将发布的ACMG/AMP/CAP/ClinGen序列变异整理4.0版框架，将提供基于致病性定量可能性的正式指南。

        一项涉及超过150,000个变异的多实验室研究显示，基于证据的VUS亚层级（VUS-low、VUS-mid和VUS-high）具有不同的重新分类轨迹：VUS-low从未升级为致病或可能致病，支持在报告中降低其强调程度；而VUS-high最有可能被升级[67]。这些发现进一步支持对VUS进行亚层级划分，因为这种做法可以改善与临床医生的沟通，帮助临床管理决策，并优先安排需要进一步评估的变异。

深度表型分析

        许多VUS之所以仍无法解决，是因为缺乏足以确立疾病关联的临床证据或功能证据。通过使用人类表型本体（Human Phenotype Ontology，HPO）等框架系统记录临床特征，开展检测后的针对性评估，并收集共分离数据，深度表型分析可以帮助填补这些证据空缺[68]。

        例如，一名患有胼胝体发育不全的早产儿被发现携带ROBO1基因复合杂合VUS[69]。进一步的临床检查发现垂体和肾脏异常，这些发现与ROBO1相关表型一致，并促使这些变异被重新分类为潜在致病变异[69]。同样，在一项纳入172名接受基因组检测的儿科患者的研究中，37.7%的患者（172名中的65名）最初获得VUS结果。经过深度表型分析后，其中65%的VUS（65个中的42个）被重新分类为具有临床意义的变异，使总体诊断率达到61%[70]。

VUS重新分析

        ACMG建议定期对变异进行重新分析，以应对不断发展的基因组学知识并确保诊断准确性持续得到维护[71–73]。随着新证据不断积累，应定期重新评估变异层面的数据和病例层面的数据。一项系统综述纳入29项研究和9,419名疑似孟德尔遗传病患者，发现基因组数据重新分析可带来10%的额外诊断率[74]。其中，大多数升级由新发表的文献（62%）或新的功能研究（11%）推动[74]。另一项研究显示，在为期4年的随访期间，携带VUS的病例中接近一半（33例中的16例）被重新分类为致病变异，强调了证据随时间累积的重要作用[73]。

        然而，重新分析也面临明显挑战：通常由医疗服务提供者发起，而且不同实验室在时间安排、范围和方法学方面存在很大差异[75]。一项调查显示，虽然外显子组和基因组数据的重新分析已广泛可用，但实际做法并不统一，而且往往缺乏透明度[75]。这些限制提示，需要制定标准化的重新分析时间间隔，更清楚地划分责任，并更加重视操作和流程方面的实际困难。

功能研究

        尽管计算工具和基于人群的资源不断进步，功能研究仍然是解决VUS最直接、最有信息量的方法之一，但其应用仍然不足。例如，一项分析48个CFTR错义变异的研究发现，若干被认为具有致病性的变异实际上并未改变蛋白功能[76]；这一结果强调了计算机模拟预测的局限性，以及实验验证的必要性。

        ACMG/AMP指南通过PS3标准（支持致病性）和BS3标准（支持良性）明确认可功能实验的价值[13]。当经过充分建立的实验能够分别证明基因/蛋白功能异常或正常时，可以应用这些标准。然而，不同实验室对PS3/BS3的应用不一致，导致分类结果不一致，也降低了人们对功能证据的信心。

        为应对这些挑战，近期建议旨在标准化并加强功能证据在变异解读中的应用[77]。首先，需要明确何谓“经过充分建立的”功能实验，并强调并非所有实验都能提供具有临床意义的信息。其次，应建立结构化评估框架，包括：（1）明确疾病机制；（2）评估实验类型的相关性；（3）评估实验的有效性和性能；（4）将功能证据应用于变异解读[77]。经过验证的功能证据已经促成BRCA1[78]和MYOC[79]等基因中VUS的重新分类。然而，由于实验具有个体化特点、报销有限且难以整合进临床流程，功能研究的可扩展性仍是一个主要障碍。

 

解决VUS的新方法

        VUS解读仍是基因组学进入临床实践时面临的最大挑战之一。尽管已经付出各种努力，仍有相当大比例的VUS未能解决。为应对这些挑战，研究者正在开发新方法，包括多组学整合、高通量功能检测和人工智能（artificial intelligence，AI）。下面将讨论这些策略，以及它们改变VUS解读格局的潜力（图3B）。

多组学整合

        VUS的解读往往需要超越DNA序列变化本身的其他信息。与传统的基因特异性功能实验相比，新型多组学和系统层面方法提供了具有可扩展性和更高通量的功能研究延伸，其中一部分已经被纳入ACMG/AMP规范。通过整合表观基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，多组学框架可以补充基因组分析，为阐明变异功能提供有力手段，并且在研究和临床环境中的应用日益增加。

表观基因组学

        DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传过程，可以在不改变DNA序列的情况下调控基因表达。对于涉及甲基化相关基因或怀疑存在基因组印记异常的病例，表观基因组学分析已经成为尤其有价值的工具。目前，越来越多罕见病被发现具有明确的疾病特异性DNA甲基化模式，即“表观遗传特征（episignature）”；现有可用的表观遗传特征已覆盖40多种疾病和60多个基因[80–82]。

        一项临床研究中，表观遗传特征检测的阳性率为27%（207人中的56人）[83]。值得注意的是，在携带VUS的受检者中（n=136），35%具有阳性甲基化特征，直接支持了表观基因组学分析解决不确定变异的潜力[83]。

转录组学

        RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）可以通过检测异常基因表达、剪接缺陷和单等位基因表达，为VUS解读提供另一层分辨率[84]。当DNA测序只检测到一个变异，而考虑的疾病为隐性遗传时，RNA-seq有助于识别第二个致病等位基因[85]。一项研究中，RNA-seq使60%的VUS（10个中的6个）得到重新分类，并带来新的分子诊断[86]。在更大的遗传性肿瘤筛查队列中，RNA-seq分析了52个基因的411个剪接相关VUS，解决了其中108个VUS（26.3%），将28个（6.8%）升级为致病/可能致病，并将80个（19.5%）降级[87]；这显示出RNA-seq在改善VUS解读方面的临床实用性。

        然而，临床应用RNA-seq的主要障碍包括：许多疾病相关基因在临床可获得组织中的表达水平较低或完全不表达；以及缺乏针对成纤维细胞和血液等样本的全转录组参考数据。为克服这些挑战，一项近期临床研究强调方法的简便性、成本效益、快速周转和可重复性，通过成纤维细胞向神经元的转分化获得神经元样细胞（iNeurons），从而检测神经元特异性转录异常。在未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network，UDN）的神经系统疾病个体中，该方法取得了25.4%的诊断率（71人中的18人）[88]。

        与此同时，另一项研究利用成纤维细胞和血液样本建立了适用于临床RNA-seq的实用框架和转录组参考资源，并在130个病例中验证了该方法（90个阴性病例、40个阳性病例），同时根据对照数据集定义了基因层面和剪接连接层面的参考范围[89]。这些进展支持RNA-seq在临床中的更广泛应用，并通过实现针对基因的转录组数据解读，提高VUS解决率。

蛋白质组学

        蛋白质组学，尤其是基于质谱（mass spectrometry，MS）的方法，正在成为解决VUS的有力工具，因为它可以对候选变异进行功能验证。与RNA-seq不同，蛋白质组学可以直接评估错义变异的后果。错义变异是最常见、也最难解读的变异类别之一。蛋白质组学可以定量分析蛋白质丰度、稳定性和蛋白复合物完整性。此外，与蛋白质印迹等传统靶向实验相比，蛋白质组学具有高通量、非靶向的特点，不要求研究人员事先知道目标蛋白或拥有相应抗体，因此即使对新发现或研究较少的基因也适用。

        这一点尤其有价值，因为据估计，近40%的错义变异会通过导致蛋白质不稳定或降解而降低蛋白表达[90]。一项研究显示，NUP214、NDUFAF8和MRPS34等基因中的VUS已经借助蛋白质组学信息成功重新分类[91]。目前，这些方法大多仍限于研究环境，但将经过临床验证的蛋白质组学工具整合进诊断流程，有望解决VUS并缩短诊断时间。

 

高通量功能检测

        传统功能实验仍然是变异分类的金标准，但其通量较低且具有基因特异性，限制了应用范围。近期高通量功能检测的进展正在改变这一格局。这些技术可以同时评估数千个变异的功能，为解决VUS提供可扩展且可重复的数据。其中最具影响力的工具包括变异效应多重检测（multiplexed assays of variant effect，MAVEs）、饱和基因组编辑（saturation genome editing，SGE）以及细胞涂绘等高内涵成像技术。

变异效应多重检测

        MAVE旨在并行评估数千个变异的功能影响，通常覆盖某一特定基因或蛋白质结构域中的全部单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）或氨基酸替换[92,93]。这类实验包括构建全面的变异文库、开展高通量功能筛选，以及通过富集或耗竭评分量化变异效应[94]。

        在一项大规模研究中，MAVE为3个具有临床意义的基因BRCA1、TP53和PTEN生成了49,281个功能评分，并解决了BRCA1、TP53和PTEN中分别为49%、69%和15%的VUS[95]。近期研究建立了MaveDB，这是一个全面的MAVE数据库，收录超过700万项变异效应测量结果[96]。此外，ClinMAVE还为821个基因中的超过210万个变异提供功能证据，并配有标准化注释、详细的实验背景以及与ACMG/AMP一致的证据分级，从而在实验数据和临床解读之间建立桥梁[97]。这些资源共同展示了MAVE数据集在系统性、可扩展变异解读中的变革性潜力。

饱和基因组编辑

        SGE是一种基于CRISPR–Cas9的方法，用于在目标基因组区域内引入并评估所有可能的SNV[98]，从而全面评估VUS的功能（表1）。该方法通过扩增子测序和基于适应度的实验，对变异进行精确的功能评分，为每个变异的潜在致病性提供直接信息。SGE已经应用于超过500,000个人类错义变异，覆盖500多个蛋白质结构域[99]。该方法已经用于对VHL[100]、BAP1[101]、FKRP[102]、LARGE1[102]、RAD51C[103]、TP53[104]、BRCA2[105,106]和RNU4-2[107]等基因进行高分辨率功能注释。这些工作为临床可操作基因中的VUS重新分类提供了坚实的实验基础，也为专家整理提供了有价值的资源。

高内涵成像：细胞涂绘

        细胞涂绘是一种高通量形态学分析技术，通过多重染色和自动化成像捕捉由遗传扰动改变的细胞内特征[108]。该方法可以通过识别细胞形态、细胞器分布和蛋白质定位的变化，间接评估变异功能。在一项研究中，研究者对1,000多个基因的3,448个错义变异进行了分析，发现约六分之一的致病变异会导致蛋白质定位异常[109]。这些定位异常与蛋白质稳定性受损和膜插入障碍有关[109]，说明细胞形态可以作为评估VUS致病性的有用读出指标。随着该方法扩展到更多细胞类型和扰动模型，其有望进一步大规模提高VUS解读能力。

表1  使用饱和基因组编辑和细胞涂绘确定遗传变异的功能影响

饱和基因组编辑

细胞涂绘

AD，常染色体显性；AR，常染色体隐性；OMIM，人类孟德尔遗传在线数据库；ccRCC，透明细胞肾细胞癌；SMuRF，饱和突变强化功能实验；SNV，单核苷酸变异；EVE，变异效应进化模型；SGE，饱和基因组编辑；AUC，曲线下面积；gnomAD，基因组聚合数据库；UMD，通用突变数据库；DepMap，癌症依赖性图谱；GVGD，Grantham变异—Grantham偏差；COSMIC，癌症体细胞突变目录；CADD，综合注释依赖性耗竭。

 

人工智能

        除用于表型提取[110]和变异检测[111]外，人工智能（AI）正在通过数据驱动、高通量且能够结合上下文的方法，日益重塑变异解读领域。AI驱动工具利用大规模基因组数据库、临床表型、计算机模拟预测结果和功能数据，以比传统框架更快、更准确的方式协助VUS的优先级排序、分类和解读。

变异优先级排序

        研究者已经开发出多种监督式机器学习（machine learning，ML）模型，直接利用进化保守性、等位基因频率和功能预测等特征对VUS进行分类。一项研究中，Mahecha等[112]利用经过整理的ClinVar数据，对随机森林、支持向量机和多层感知器模型进行了基准评估，并据此开发了VusPrize。VusPrize是一种开源VUS分类器，针对研究和临床应用进行了优化。

        其他AI工具将表型数据与测序信息结合起来，自动完成变异优先级排序。例如，一个以知识为指导的机器学习流程AI-MARRVEL利用超过350万个经专家整理的变异及其关联表型数据进行训练。在871名受试者组成的队列中，该流程达到了98%的精确率，并解决了57%的可诊断病例[113]。这一方法优于现有算法，并且有助于重新分析和新基因发现。

变异分类与解读

        机器学习已经增强了基于ACMG/AMP指南的变异分类。一种使用结构化ACMG/AMP标准和变异注释进行训练的惩罚逻辑回归模型，生成了致病性概率评分，其表现优于传统的规则型方法和计算机模拟方法[114]。

        在一项对105,172个重新分类变异的综述中，64,840多个变异（61.7%）涉及VUS；这些变异大多被降级为良性或可能良性。其中超过一半（57.2%）的重新分类由机器学习模型推动，模型利用了等位基因频率阈值、功能预测和剪接影响等信息[115]。值得注意的是，表现最好的模型是由机器学习研究人员与临床遗传学家共同开发的；临床遗传学家的领域知识有助于微调模型性能并确保临床相关性[115]。

        AI在整合功能基因组学数据方面也发挥着关键作用。一项研究将MAVE与机器学习框架结合，为57,000名个体中的4,043个变异提供了功能分类，说明高通量证据可以扩展到人群层面的变异解读[116]。

        大语言模型（large language model，LLM）代表了一个有前景的新方向，可用于自动化证据整合、文献挖掘，甚至开展个体化变异解读[117,118]。近期一项研究介绍了AutoPM3，展示了面向特定领域的大语言模型在变异解读中的潜力：AutoPM3将基于Text2SQL的变异提取、检索增强生成和针对变异的微调检索相结合，在一个源自ClinGen的基准数据集上，变异识别准确率达到86.1%，反式变异召回率达到72.5%[119]。这些结果强调，需要在经过整理、具有临床注释的数据集上对大语言模型进行微调，并纳入真实世界的临床背景。

        然而，近期对11个大语言模型进行的真实世界评估显示，当模型处理患者自行描述的遗传病情况时，表现有限，最高准确率仅为21%[120]。与此同时，近期报告也强调，在遗传分析中应用AI存在显著伦理挑战，包括基因组数据具有高度敏感性和独特可识别性所引发的隐私、知情同意和数据治理问题[121,122]。算法偏倚、透明度有限、责任归属不清，以及监管和操作层面的缺口，尤其是在将表型和电子病历（electronic medical record，EMR）数据与基因组数据库整合时，仍然阻碍AI在临床中的安全部署，也凸显了建立严格验证标准和治理框架的必要性[123–125]。

        为了充分发挥AI解决VUS的潜力，未来工作必须继续应对数据质量、模型透明度、临床整合和伦理监督等挑战[126]。最终，要解决当前已经收录的数百万个VUS，需要建立具有可扩展性、可解释性并与临床整合的AI框架；这些框架不仅要加快变异解读，还要确保精准医学中的实施公平、负责。

 

结论

        VUS仍然是基因组医学中的重大挑战，并对诊断和治疗产生重要影响。尽管测序技术发展迅速，变异解读仍然相对滞后。本综述总结了有助于解决VUS的主要策略，包括大规模人群数据库、数据共享、计算机模拟工具、深度表型分析、重新分析和功能验证。尽管采用了这些方法，大多数VUS仍未得到解决，这说明我们仍然需要由多样性驱动的基因组数据、可扩展的功能实验以及临床整合。

        多组学、MAVE、SGE、细胞涂绘和AI等新工具展现出较大潜力，但其影响将取决于审慎实施、清晰的监管要求和公平可及性。最终，解决VUS需要将创新与临床工作流程、专家整理以及以患者为中心的医疗照护相结合。

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TargetCap® Core Exome Panel v3.0

       TargetCap@ Core Exome Panel v3.0基于伯科高品质DNA探针合成技术开发，全流程国产制造，由~40万条探针组成，以GRCh38/hg38人类参考基因组设计，参考Refseq、CCDS、ClinVar等数据库，覆盖19,524个基因，目标区域为33.9Mb。

捕获性能比较

伯科全外芯片v3.0性能优异与国外友商同类型产品v2相当，中靶率、覆盖率、覆盖均一性等参数均达到国际领先水平。

适配高通量流程平台

批次稳定

使用不同批次TargetCap® Core Exome Panel v3.0芯片对NA12878 gDNA进行捕获测序，结果显示，不同批次芯片在不同测序平台上均显示出优异的稳定性，不同位点的相对深度相关性高，批次稳定。

变异检测准确

单核苷酸变异(SNV)和插入缺失 (INDEL)是基因组变异的常见形式，也是引起人类疾病的重要原因。

 

选取NA12878标准品，与预期SNV和INDEL变异进行比较。结果表明，在MGI与Illumina测序平台，SNP灵敏度为99.1%，INDEL灵敏度为91.6%。

添加线粒体模块临床样本表现

20例全血样本(S1#-S20#)，采用1-4 Plex方式使用TargetCap® Core Exome Panel v3.0添加线粒体模块进行过夜杂交捕获；其中，S1#-S10#在Illumina NovaSeq X Plus平台测序， S11#-S20#在MGI MGISEQ-T7平台测序，均采用150PE模式测序。得到测序数据后，抽取8Gb数据进行生信分析。

 

两种测序平台的数据表现相近，平均深度分别为111x/115x (Illumina/MGI)，中靶率优异均＞ 85%，覆盖均一性极佳(0.2X_MD≥99.3%)；仅使用8Gb数据，高达98.5%的捕获区域达到了30X以上，99.5%的捕获区域达到20X以上，为临床样本检测提供了可靠的捕获数据。

≥0.2X/0.5X_MD: Mean Depth，覆盖深度≥平均深度的0.2/0.5倍深度的区域占总区域的比例，用于表征覆盖均一性性能，越接近100%越好。

 

 

TargetCap® Core Exome Panel v7.0

        TargetCap® Core Exome Panel v7.0（下文简称BOKE v7.0），该WES Panel增强了基因组hg19传统研究区域的覆盖，兼顾 hg19 & hg38 双版本基因组，可以更好的保证临床科研与转化的延续性。目标区域和捕获区域大小分别为40Mb和49Mb，对 hg19 传统研究区域覆盖提升至99.7%（友商I-v1），hg38传统研究区域覆盖相近（友商A-v8）。同时，新添加数百个具有一定功能与表型的基因，总基因数量达到20000+。

BOKE Core Exome Panel v7.0目标区域大小以及对不同友商产品目标区域的覆盖情况

 

在捕获性能方面，TargetCap® Core Exome Panel v7.0依然表现优异，与TargetCap® Core Exome Panel v3.0表现相近。在测序9Gb条件下，平均深度达到110x左右，20x和30x以上区域占比分别为99.5%和98.5%，Fold 80为1.5-1.6之间，与国际领先产品数据表现相当。

        同时，TargetCap® Core Exome Panel v7.0也可灵活的与拓展模块组合使用，满足不同场景的临床研究的需求及转化应用，包括线粒体、遗传病非编码区变异位点、单基因全覆盖、病毒基因组、肿瘤全景变异检测、重大疾病多基因风险评估模块等。此外，伯科公司自研自造的寡核苷酸合成平台可以快速响应个性化定制的需求，为人类基因组分子遗传学的研究与转化，提供更加全面高效的解决方案。

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