此“疫苗”非彼“疫苗” | mRNA癌症疫苗进入新发展阶段

癌症疫苗旨在通过肿瘤抗原来诱导人体免疫反应,杀死癌细胞;癌症疫苗更多的是一种治疗性疫苗,而非传统意义上的预防性质。肿瘤抗原可以通过不同的形式递送,比如DNA、信使RNA(messenger RNA,mRNA)和多肽等;顾名思义,mRNA癌症疫苗采用mRNA形式递送肿瘤抗原。

通过癌症疫苗治疗癌症[1]

众所周知,RNA极不稳定,容易降解;同时,由于mRNA分子较大且带负电,无法通过细胞膜的阴离子脂质双层;此外,人工合成的mRNA会被机体免疫系统识别,诱导免疫反应并降解或抑制mRNA,安全性和有效性也是问题。因此,想要让人体细胞接受外来mRNA并高效表达目的蛋白并不容易。

1987年底,Robert Malone完成了里程碑式的“分子乱炖”实验,他用脂滴将mRNA送入人体细胞,并成功表达蛋白[2]。Malone意识到这一发现可能对医学产生深远影响,于是做下笔记并签上了名字和日期。他写道,如果细胞能使用被递送到其内部的mRNA合成蛋白,那么“treat RNA as a drug”。同年末,Malone又证明了脂滴也能将mRNA递送到青蛙胚胎中[3]。这是第一次有人用脂滴帮助mRNA顺利进入活生物体。1996年,David Boczkowski等人在体外实验中首次证明了mRNA癌症疫苗的抗肿瘤活性[4]。

Robert Malone实验室笔记本的摘录,描述了1989年注射到小鼠体内的mRNA合成[5]

在过去的十多年里,mRNA结构研究、核酸递送技术取得重大技术创新,RNA序列工程优化使人工合成的mRNA比以往任何时候都更易于翻译,mRNA的先天免疫原性得到控制,安全性和有效性进一步提高,同时,更安全、高效、精准的递送系统还进一步提升了mRNA使用的灵活性。

非编码区(5’/3‘ UTR)是mRNA的稳定性和翻译的关键之一;5’端帽结构在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解,并与3’ PolyA、翻译起始因子蛋白等协同翻译蛋白,共转录封盖技术简化了工业化生产;poly(A)尾巴的长度间接调节mRNA的翻译和半衰期,足够长的3’尾(100–150bp)是其与聚(A)结合蛋白相互作用所必需的,同时保护5’ 帽不被去帽酶降解。mRNA编码区(ORF)碱基序列构成可能会影响mRNA翻译效率以及蛋白折叠的准确性,碱基修饰则在能让mRNA“伪装”成内源性mRNA,躲避先天免疫系统的攻击[6]。

体外转录mRNA的5个结构原件[6]

人体天然RNA含有大量碱基修饰,一旦人工合成的外源mRNA不携带相关修饰,便会被人体先天免疫系统识别为外来RNA,并将其清除,向mRNA中添加假尿苷(Ψ,Pseudouridine)等修饰核苷似乎能降低其免疫原性,防止机体视其为敌人,保证翻译产生足够水平的蛋白;相反,mRNA疫苗也可以作为一种PAMP(Pathogen-associated molecular pattern),用于激活先天免疫,并协同作用于特异性T细胞免疫,达到杀伤肿瘤细胞的目的[7]。

先天免疫识别mRNA疫苗[8]

肿瘤抗原分为两类,一类是肿瘤相关抗原(TAA),在肿瘤中异常表达,但也少量存在于正常细胞,另一类是肿瘤特异性抗原(TSA),其不存在与正常细胞中,特异性更高,比如基因突变产生的新抗原(Neoantigen)等,按照抗原类型不同癌症mRNA疫苗可以分为TAA疫苗(固定)和TSA疫苗(个性化)。

TAA mRNA癌症疫苗是针对固定的肿瘤相关抗原,可以提前制备,属于即用型。2021年11月,美国FDA授予BNT111快速通道资格,BNT111就是一种TAA mRNA癌症疫苗,它可以靶向抗原呈递细胞,激活抗原特异性T细胞反应。BNT111利用mRNA编码4种固定的黑色素瘤相关抗原,包括NY-ESO-1、MAGE-A3、Tyrosinase和TPTE抗原,可以覆盖~95%的黑色素瘤患者[9],BNT111在1期临床试验中表现出积极的结果[10]。

BNT111采用固定化肿瘤相关抗原mRNA疫苗[10]

TSA疫苗需要根据个性化新抗原定制,高通量基因测序技术的发展为研究者们提供筛选肿瘤新抗原的强有力支撑,由于mRNA疫苗可以快速且经济高效地生产,因此特别适合“按需”设计和制造。

2017年7月,基于TSA的个性化癌症疫苗获得里程碑式突破,美国和德国两个研究团队相继在《Nature》杂志发表关于新抗原肿瘤疫苗用于治疗黑色素瘤的Ⅰ期临床研究结果。德国美因茨大学团队报告了首次应用在人体的一种基于mRNA的个性化定制癌症疫苗治疗方案[12]。通过基因组全外显子测序(dWES,用于配对细胞样本)与转录组全外显子测序(rWES,FFPE RNA捕获),获得个体肿瘤特异的基因变异图谱,随后筛选候选新抗原,并将其克隆至mRNA中(一条mRNA分子编码5种新抗原),为每位患者定制和制造独特的疫苗。参与试验的全部13名黑色素瘤患者中,有8名患者在23个月里没有再出现肿瘤,结果令人振奋,也是首次在临床上证明了新抗原肿瘤疫苗能够唤醒人体沉睡的免疫武器。

BNT121采用个性化肿瘤新抗原mRNA疫苗[11]

2022年10月,默沙东宣布向Moderna支付2.5亿美元,合作开发个性化mRNA癌症疫苗mRNA-4157(一条mRNA编码多至34种新抗原),将其与默沙东的抗PD-1单抗Keytruda联用,进行治疗高危黑色素瘤患者的2期临床试验。仅在2个月后,Moderna与默沙东联合宣布,mRNA-4157联合Keytruda治疗黑色素瘤的2b期临床达到主要终点,黑色素瘤患者的复发或死亡风险降低了44%,将在2023年开展3期临床试验,并将扩展到其他癌症类型的治疗。无独有偶,BioNTech公司创始人也在接受采访中表示,BioNTech公司在mRNA癌症疫苗领域已经取得突破,预计2030年之前上市使用。mRNA疫苗是一项平台型技术,作为癌症疫苗,期待它为癌症治疗带来新的机会。

伯科生物自主开发的人全外显子液相基因芯片(Core Exome Panel v3.0)不但可以用于基因组DNA变异检测,也同样可以用于FFPE RNA的转录组捕获,rWES能够克服FFPE样本RNA降解引入的覆盖偏好性问题,帮助准确获取变异序列的转录表达信息,提高新抗原预测准确性。伯科生物自主开发的SynStar21多功能Oligo合成仪,硬件和软件系统可以满足从科学试验到药物研发等不同DNA和RNA序列的合成需求。

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针对FFPE样本,Total RNA-Seq和rWES Cap分别测序108/115Gb和6.2Gb,按照WES Bed区间进行统计,Total RNA-Seq和WES Cap去Duplication后的测序深度分别为60.6x/72.1x和109-110x;覆盖率方面,由于针对基因组序列设计探针,WES Cap略低于Total RNA-Seq 2-4%;与Total RNA-Seq相比,WES Cap的On-Target(Reads)为93-96%,富集18-34倍,富集效率与先前RNA-Cap的报道一致[12],Gene Panel的目标基因越多,其富集效率越低。此外,WES Cap的Exonic占比为72.9-76.3%,呈现经典靶向富集表现。在转录本覆盖均一性上,WES Cap与Total RNA-Seq相似,无明显偏好。

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