分割检测、个体化质控 | 半固定MRD Panel - RaDaR技术浅析
- boke
- 2022-09-15
- 7:21 上午
RaDaR™是一种基于Inivata公司InVision®平台技术的Tumor-informed多重PCR的NGS测序。RaDaR™旨在追踪48个患者特定的变异，用于检测多种肿瘤类型的MRD，可用于治愈性治疗后或复发的早期检测。RaDaR™于2021年3月获得美国食品和药物管理局的突破性设备认定[1]。Inivata公司报告说，RaDaR™的VAF检测限为0.001%，从样本采集到报告的反馈时间约为七天[2]。
RaDaR™技术前身可以追溯到2012年的报道[4]，被称为Tagged Amplicon Sequencing (TAm-Seq)。如图1所示，该技术是一种基于PCR原理的靶向测序技术，整体思路和巢式PCR相似，由三步PCR完成。
利用Primer Pool进行多重PCR扩增，得到多靶标混合物；
在上一步产物的基础上进行1-plex PCR，保证每一对引物都高效工作，该步骤通过微流控技术实现；
将上一步产物Pooling后，利用通用引物和index Primer进行标记，随后上机测序。
对于等位基因频率为2%的ctDNA，TAm-Seq可以达到超过97%的灵敏度和特异性。
图1 RaDaR™技术前身TAm-Seq工作原理示意图[4-6]
如图2所示，不同于TAm-Seq（“伪多重”，依靠微流控1-plex PCR实现），TAm-Seq技术进一步优化，在不依赖UMI的前提下，采用“分割策略（Partitioning）”，通过对每个反应中的DNA拷贝数、阳性判定条件（≥2孔或3孔）等参数进行调整，提高信噪比[8]。
该流程通过两步PCR完成，1）目标区域多重PCR；2）Index PCR。针对41对扩增引物，为了实现将样本分割成48份，研究人员在每对引物的正向和反向引物的5’端增加了Barcode（BC），用于不同分孔的标记（Inner Barcode），这个位置通常是UMI的区段，整个反应的装配仍然通过微流控工艺完成[8]。
升级后的TAm-Seq（enhanced TAm-Seq™ (eTAm-Seq™)）能够检测到低至0.02% AF的突变等位基因，单碱基特异性高达99.9997%。在两个独立实验室的测试中，对于最佳的DNA input样本，eTAm-Seq™对等位基因频率（AF）为0.25%-0.33%的检出率为94%[7]。
在LIONESS研究中（Liquid BIOpsy for MiNimal RESidual DiSease Detection），RaDaR™技术表现亮眼。在手术前采集的血浆样本中，基线ctDNA的VAF水平在0.014%至0.97%之间。在手术后的样本中，可以检测到ctDNA的水平低至0.0006% VAF[3]。
整体而言，RaDaR™技术在TAm-Seq基础上有如下细节调整值得关注：
