极致周期-案例分享 | 4天交付1Mb个性化Panel

2021-11-08

说明:

本文展示数据获得用户公开许可。

用户需求

1. 4天内交付Panel。

2. 可执行大规模Pooling杂交,≥20个样本/Capture,且与6-Plex的SNP一致性100%。

3. 单独变性文库后加入探针的常规流程太繁琐,探针与文库能够共变性,且不影响Panel性能。

该个性化Panel的捕获区域为1.1Mb捕获区域(下文简称CD Panel),含有10,251条探针(图1)。依托自主高通量合成平台,伯科按时交付Panel,保证了用户研发实验的顺利开展。对于后两点需求,CD Panel超额完成任务,胜任24-Plex和共变性,表现完美

图1. 个性化Panel基本信息

对Coriell标准品(NA12878,NA24694)超声打断建立预文库并进行6-Plex和24-Plex杂交捕获,在Illumina平台测序。如图2所示,6-Plex和24-Plex捕获表现几乎完全一致。两种杂交方式均能达到覆盖目标区域99.9%、冗余度(Duplication)3%~4%、On-Target(Bases)为63%~64%,0.2x Mean和0.5x Mean分别为99.4~99.5%,94.6~99.6%,≥20x深度占比99.5%,Fold80达到1.26-1.30,表现堪称完美。

图2. 6-Plex与24-Plex捕获数据表现(0.2Gb)

Downsample结果显示,在0.2-1Gb数据量范围内,24-Plex并未降低数据有效性,在不同数据量下其达到的深度相近,同时也不影响覆盖均一性,Fold80保持在1.23-1.27之间,值得一提的是,各项参数在样本重复间的CV波动均控制在1%以下(未展示),表现出优异的稳定性。

图3. 6-Plex、24-Plex测序深度及Fold 80的Downsample表现

以~300 Gb WGS数据(~100x Depth,Illumina)作为参考,比较不同数据量下6-Plex和24-Plex的VAF(杂合位点)变化。如图4所示,随着测序数据量的增加,VAF离散程度和样本间的CV明显降低,6-Plex 和24-Plex无明显差异,NA12878和NA24694趋势一致。同时,在不同GC含量(25%~70%)的条件下,6-Plex 和24-Plex 检测到杂合位点的VAF值稳定在0.5附近,不同数据量下,单位点样本间VAF CV在5-10%。除在较低深度测序时25% GC附近出现了轻微波动外,无明显GC偏好。

图4. 6-Plex、24-Plex不同数据量下的VAF表现

如图5左所示,伯科为高通量操作流程的实现开发了相应的解决方案(HT),其中就包括文库与探针的共变性。根据不同共变性时间以及其在不同文库投入量下(500-5000ng)的测试数据及经验(图5右),我们为用户推荐了共变性时间。

图5. 适配高通量流程技术解决方案及共变性时间摸索(0.3Mb Panel)

采用共变性对CD Panel进行24-Plex捕获,其数据表现如图6所示,对常规流程24-Plex相比,二者无明显差异,共变性的均一性和On-Target有微弱提升,可能是短时间变性对文库损伤减小的缘故。

图6. 低通量(LT)、高通量(HT)不同操作流程覆盖率、均一性表现(0.2Gb)

在捕获表现合格的基础下,对LT和HT的24-Plex样本的VAF进行分析发现,两例标准品在LT和HT流程条件下的VAF高度相关,如图7所示,在测序0.4 Gb ~200x深度的条件下的VAF高度相关,R2≥0.99。

图7. 24-Plex,LT/HT操作时NA12878与NA24694的VAF表现

结语

~10,000条高品质探针,4天极速交付,24-Plex,共变性适配高通量流程,捕获表现优异,变异检测准确,伯科超额完成CD Panel的预定指标。同时,伯科严谨的工作态度和强大的执行力,也令用户印象深刻。从实际应用出发解决用户痛点,是伯科研发的宗旨,凭借在捕获原理上积累的丰富经验,也让伯科能够更快的响应用户新的需求。

推荐阅读