技术小贴士 | 为什么是0.4 fmol each/rxn？探针用量测试
- boke
- 2022-07-28
- 7:31 上午
在之前的文章中，我们多次提到了0.4 fmol each/rxn的探针用量，在本文中，小编为大家介绍推荐该用量的具体原因。
不同目标区域由于碱基组成不同（主要是GC含量），其相应的探针与目标区域的结合效率存在差异，比如对于正常GC区域，较低的探针用量就可以饱和捕获目标片段，反之，GC异常区域则需要更高的探针用量（图1）。
图1 探针用量对捕获表现的影响示意图
实验设计如下，测试探针与目标片段分子数量比例102:1到104:1区间，每条探针摩尔量为0.05-5 fmol/rxn，对NA12878标准品进行杂交捕获，每种条件2个重复。捕获富集后高通量测序，在相同数据量条件下统计目标区域捕获表现。
图2 探针用量测试实验设计
如图3所示，随着探针用量的增加，覆盖均一性逐步提高，Fold80和平均深度占比在0.4 fmol each/rxn时达到最优，该用量下，探针与目标片段分子数量比例为103:1左右；同时，捕获到的目标片段的丰富度也在逐渐提升，Duplication降低。此外，探针用量的增加也将提升与探针近似匹配区域的覆盖，体现为Off-Target增加，特异性降低（On-Target）。
图3 0.05-5 fmol each/rxn探针用量的捕获表现
再按照GC含量差异对不同目标区域的覆盖进行分析，如图4所示，在0.05 fmol each/rxn探针用量条件下，与中等GC相比，低GC与高GC目标区域的覆盖更低且高GC区域波动更大；当探针用量达到0.4 fmol each/rxn时，不同GC区域的覆盖相对均匀，无明显GC偏好，证明不同GC目标区域的探针结合效率存在差异，探针用量的增加弥补了低亲和力区域的覆盖深度。当探针用量达到0.8 fmol each/rxn时，覆盖均一性与0.4 fmol each/rxn条件下相似，间接说明0.4 fmol each/rxn条件的探针用量为饱和探针用量。
图4 探针用量对不同GC区域的覆盖影响
综上所述，通过探针用量梯度测试，我们发现0.4 fmol each/rxn具有最佳的覆盖均一性，不同GC目标区域的结合效率差异得到有效控制。探针用量减少通常会增加中靶率，对于覆盖特殊区域的特异性较差的Panel，适当降低探针用量，选择接近饱和状态的探针用量也是有效的调整方法。
