Tumor-informed Safe-SeqS MRD技术梳理
- boke
- 2022-07-18
- 7:21 上午
在上一篇文章中（NEJM | Tumor-informed Safe-SeqS MRD检测指导II期结肠癌辅助治疗），我们介绍了NEJM近期刊登的一项关于利用血浆ctDNA检测技术指导结肠癌术后辅助化疗的临床研究，试验结果积极[1]。
本文将简单回顾上述研究中ctDNA检测的湿实验环节，并对该研究中使用的ctDNA检测方案-“Safe-SeqS”的技术发展进行梳理。
如图1所示，该研究采用Tumor-Informed方案开展MRD检测，通过15-Gene Panel对患者的FFPE样本进行靶向高通量测序，筛选体细胞突变位点；采集30-60mL血液样本，并从10mL以上的血浆中提取cfDNA，从FFPE的15-Gene Panel基因变异数据中挑选至少一个体细胞突变位点对cfDNA中的ctDNA进行追踪。
ctDNA检测采用Safe-SeqS多重PCR纠错技术，将cfDNA样本分割检测，分别分成12、24或95孔，每孔0.5-3 ng。12和24孔，以及95孔分割的样本采用不同的方法对样本和对照DNA的突变等位基因频率（MAF）差异进行统计分析，P＜0.1判定为ctDNA阳性。
Safe-SeqS是什么技术，其经历了哪些优化和调整，而且，为什么要对cfDNA进行分孔检测？此外，Safe-SeqS多重PCR可以一次检测多少位点，引物设计难度如何，是否能够满足MRD的时效性要求，带着这些疑问我们继续往下看。
图1 肿瘤组织突变分析与ctDNA追踪的实验方法
Safe-Sequencing System (“Safe-SeqS”) 在2011年首次提出，其基本思想是通过单分子标记（UID，unique identifier）减小样本制备阶段和测序环节的错误，准确评估低频突变。当然，大家现在对这个思路比较熟悉了。如图2所示，UID标记后的分子再通过PCR并测序，相同UID分子标记的Reads中≥95%的Reads支持的变异被认为是“Supermutant”，这一思路可以在基于PCR或捕获方式的富集路线中实现[2]。
图2 Sefe-SeqS技术UID标记原理示意图[2]
基于PCR靶向扩增的Safe-SeqS技术，最初的实验流程如图3所示，首先使用带有12N或14N随机碱基（UID）的UID Primer进行第一轮PCR，两个循环，使原始Unique模板被标记上不同的UID，同时，也具有上下游扩增的通用序列（UID PCR），再使用Exonuclease I（Exo I）消化残留的UID Primer，然后进行第二轮PCR（25cycles），添加样本区分作用的Index标签（Index PCR），完成文库构建后高通量测序。
图3 Safe-SeqS第一代实验流程[2]
2013年，Kinde I[3]等在第一代实验流程的基础上对Safe-SeqS进行了优化，Exo I核酸酶被替换成RecJf，用于提高UID Primer清除效率，并在UID PCR后加入纯化环节，进一步减少残留UID Primer的干扰，Index PCR循环数从25减至23（图4）。
此外，该研究也提供了多重PCR引物的设计和优化信息，1)采用Primer 3对12个基因(12-Gene)的感兴趣区域设计多重PCR引物，其中，60%的引物一次性设计成功，可以获得目标条带，剩余的40%需要二次以上设计以提高特异性和扩增效率。2)引物优化后的12-Gene Panel含有46对引物，分为6个反应进行Safe-SeqS检测，每个反应含有6-9对引物。
图4 12-Gene Panel的Safe-SeqS技术流程图[3]
2016年，Wang Y等[4]对Safe-SeqS技术进行了较大调整，覆盖17-Gene的133对引物被分成3个Tube进行扩增，UID PCR循环数由最开始的2个循环调整为15个循环，并删除了UID Primer酶切消化环节，Index PCR使用UID PCR产物的1/400（0.25μL）进行扩增（图5）。多重PCR的多重数从6-9重/Tube，提升至~40重，有了明显提升。
可能是由于Safe-SeqS原流程中2轮UID PCR的标记效率有限，为提高模板的利用率（文库转化率），所以增加了UID PCR循环数；上述调整并未放弃UID标签的纠错功能，只是将 “绝对定量”调整为相对定量。
图5 Safe-SeqS技术由“绝对定量”调整为相对定量[4]
“绝对定量”示意图如图6左所示，假设有3个模板，其中1条含有突变位点，MAF（Mutant Allele Frequency）=33.3%，2轮UID PCR后，每个模板被标记上UID（通用序列未显示），分别为UID 1#、UID 2#和UID 3#，Index PCR后每个UID+Template被大量扩增，UID 2#+Template中≥95%的Reads含有相同突变位点，被判定为“Supermutant”，MAF=1(Supermutant)/3(UID Number)=33.3%。
但是对于低频突变，2轮UID PCR的UID标记效率有限，痕量的突变模板丢失的风险较大，因此，增加UID PCR的循环数可以增加模板的标记效率，但是相同的模板会被标记到不同的UID中（图6右），MAF虽然仍是33.3%，但UID的数量与原始模板不再是理论的1:1，即相对定量。
图6 UID PCR循环数调整后，对目标片段的评估由“绝对定量”调整为相对定量
2016年，在“相对定量”Safe-SeqS的基础上，Tie J等人[5]将UID PCR产物用量从0.25μL（1/400, in 100μL）提高至2.5μL（1/100, in 250μL），可能是为了提高取样的代表性以及操作的稳定性。此外，我们看到了对cfDNA的24孔分割操作（0.5-3 ng each），但具体原因未见描述（图7）；此外，15-Gene Panel的多重PCR引物的分组情况也未见阐述。小编继续查阅文献寻找答案。
图7 “相对定量”Safe-SeqS的进一步优化[5]
2018年，Science报道了一种名为CancerSEEK的液体活检方法，利用血液ctDNA和蛋白标志物可以对8种癌症进行早期筛查[6]；如图8所示，ctDNA检测方法采用Safe-SeqS多重PCR技术，使用15 Cycles的UID PCR（“相对定量”），目标区域为16-Gene，由61对引物组成，分为两个反应进行扩增（28/33对），每个反应包括6个重复，在96孔板中共占一排，便于高通量批量处理，提取的75μL cfDNA按照5μL/孔加入。
研究中对多孔划分方案的原因进行了阐述，由于检测灵敏度通常受到突变等位基因比例的限制，将提取的cfDNA分为多个小份，虽然减少了每个孔的DNA拷贝数，然而，它增加了突变分子的比例(2/600→0/100、0/100、0/100、0/100、1/100、1/100？)，使得突变更容易检测。而分割为多少份更优，文章并没有提及。本研究采用的12孔分割，并不是优化设计，而是技术条件限制。其次，分割策略还可以在多个孔中检测到的突变提供的重复信号。因此研究者认为这种分割策略能提高信噪比。
图8 16-Gene Safe-SeqS工作流程图[6]
综上所述，Safe-SeqS多重PCR靶向检测技术经历了十余年的发展，单分子标签（UID）纠错是低频突变检测的核心，UID PCR从2 cycles优化至15 cycles，用于提高模板利用率，UID Primer酶切消化步骤随之删除；cfDNA分割检测有利于提高突变等位基因频率并提供重复信号，提高信噪比。上文报道的多重PCR的重数≤200[6]，用于个体化MRD变异追踪比较富裕；PCR引物设计的一次性成功率为60%[3]，如果二次或三次设计优化，MRD周期上有一定隐患；此外，不同扩增子（引物对）之间还可能存在相互干扰[4,6]。先前NEJM报道的MRD检测指导II期结肠癌辅助治疗研究采用15-Gene 多重PCR Panel筛选个体化变异追踪位点，不存在全新位点重新设计的问题。那这种策略能否适用于更多的MRD应用场景呢，我们期待更多的深入研究。
