Cross-Contamination≤0.05% | 伯科 UltraPu DNA Oligos超纯工艺
2021-11-26
记得好多年前小编刚学习NGS，实验中，前辈时常告诫，“用长枪头啊，不然容易串”， “Adapter别加多了，容易串”，苦口婆心的告诫翻译一下便是，样本交叉污染后无法区分，接头残留有Index-Hopping隐患，千万别让样本交叉污染了。
图1. NGS样本串扰来源[1]
高通量是NGS的技术特征，如今的测序仪一次运行便能同时检测上百份样本的上万个基因，但如何有效区分样本，充分发挥NGS高通量的优势，还需要精雕细琢。以碱基序列为基础的样本辨识系统，Index准确性是NGS发挥高通量优势的关键，UDI的使用从理论上极大降低了Index-Hopping带来的样本串扰风险，但DNA Oligos底层生产工艺依然决定着UDI能否充分发挥作用，特别是一些特殊场景，比如检测超低频突变的MRD应用。
HPLC是一种性价比较高的Oligos纯化方式，Adapter/Index Primer一般采用HPLC进行纯化，不同引物在纯化后，仍然会少量残留在纯化柱中。如图2所示，依次纯化A，B，C三条DNA Oligos，然后对收集的oligos进行NGS测序，数据分析结果显示Oligos之间存在最高约0.1%的交叉污染，证明如果不对生产工艺进行优化很难达到更低的交叉污染率。那么，独立纯化Oligos是否能有效降低交叉污染呢?
图2. HPLC依次纯化产生约0.1%的交叉污染
我们尝试独立纯化A/B/C三条Oligos，同时，为验证气溶胶污染，分别将三条Oligos在同一个或各自独立的密闭空间内加热，如图3所示，NGS结果显示，独立纯化并在独立密闭空间的组合将交叉污染降低至0.01%以下，同一密闭空间的实验组（气溶胶）交叉污染有微弱提升，但并不明显。上述结果表明，纯化柱残留是HPLC纯化的主要污染源，气溶胶其次。
图3. 独立纯化能够明显降低oligo之间的交叉污染
明确了工艺关键点，伯科开发出一套超低交叉污染Oligos生产工艺，推出UltraPu DNA Oligos，该工艺生产的DNA Oligos能够达到≤0.05%的污染率，如图4所示，使用UltraPu DNA Oligos工艺生产24个单端Index PCR Primer，采用NGS对上述24条Index PCR Primer以及同批质控Oligos和交叉污染阳性（0.6%）阴性（~0.01%）对照Index PCR Primer进行测序，结果显示，除编辑距离较小的两条Index PCR Primer交叉污染达到0.05%外，其余Index PCR Primer均≤0.04%，对照Oligos表现符合预期。
图4. UltraPu DNA Oligos 工艺单端Index PCR Primer交叉污染表现
结语
降低Oligo之间的交叉污染，是从源头上保证下游样本测序质量的关键，UltraPu DNA Oligos的超高性能表现，将为NGS应用提供稳定的底层技术助力。除了Oligos纯度外，NGS的很多环节都可能引入样本的串扰问题，例如使用单端Index进行多样本杂交时，最高可引入0.4%的样本串扰[1]，因此，在检测体细胞突变时应更为谨慎，而超低频突变检测（0.02%）采用1对1捕获更为稳妥。
参考文献
[1] Macconaill L E , Burns R T , Anwesha N , et al. Unique, dual-indexed sequencing adapters with UMIs effectively eliminate index cross-talk and significantly improve sensitivity of massively parallel sequencing[J]. BMC Genomics, 2018
