技术小贴士 | 用多少文库捕获合适？预文库投入量与有效深度的关系
- boke
- 2022-06-30
- 7:21 上午
在捕获实验中，我们经常遇到的一个问题是使用多少ng的预文库进行捕获。如果预文库用得太多，一旦捕获实验发生意外，剩余的预文库不足以二次捕获。预文库用量也会影响研发过程中的实验设计，比如一些较多条件的测试实验。此外，对于一些特殊应用场景，比如检测cfDNA的低频突变时，预文库的用量是否会影响有效深度，也是研究人员较为关心的问题。
因此，我们设计了以下实验来检测不同预文库投入量条件下的Unique Depth表现。如图1所示，采用较低的10ng DNA起始量进行预文库(PreLib)构建，模拟实际cfDNA靶向测序应用场景，然后分别采用5-100%的投入量比例(6种比例)进行靶向捕获测序；例如，PreLib产量为1000ng，5%的投入比例为50ng，100%投入比为1000ng。捕获后PCR循环数保持一致，尽可能减少变量引入。下面，我们一起看看分析结果。
在40000x理论深度的数据条件下进行分析，5%预文库用量(Fraction)的Duplication和Unique Depth最差，分别为90%和1400x左右，明显低于100%预文库用量的表现(图2左)。随着预文库用量比例的增加，其Duplication和Unique Depth逐渐改善，在25%比例时趋于平缓。以100%预文库用量为标准(100%)，计算不同预文库用量比例的相对深度(Relative Unique_Depth)，5%、10%、25%、50%、75%和100%的预文库用量比例，其相对深度分别为75%、91%、98%、100%、99%和100%。相对预文库全部投入，在10%用量比例时可以获得约90%的有效深度，25%投入时接近100%。
图2 40000x理论测序深度下，不同预文库用量比例的捕获表现
5%的预文库投入比例仍然可以获得75%的有效深度，该比例可能有些虚高，因为100%投入比例的Duplication是低于5%投入比例的；如果想要获得更准确的结果，所有条件都需要饱和测序来获得更精确的Unique_Depth数据。
相对来说，5%的投入比例测到的Unique片段还是比较可观，这与液相基因芯片的捕获原理是一致的(技术小贴士|PCR是偏好之源？对Capture而言并非如此)。在实际应用中，我们推荐10%-25%以上的预文库投入比例，对于cfDNA靶向捕获测序，更推荐25%以上的预文库投入。
