个性化定制Panel-甲基化
应用背景
DNA甲基化是非常重要的表观遗传修饰之一，对染色质结构和基因表达具有重要影响，主要参与基因沉默的建立和维持。DNA甲基化主要发生在基因组中CpG胞嘧啶的第五位碳原子上，在大多数动物、植物、真菌模型里都是进化保守的。人类基因组正常建立甲基化模式对染色质的结构、转录、发育等起着至关重要的作用。哺乳动物基因组CpG位点普遍是高甲基化的，但在一些特殊位点呈现低甲基化，如CGI (CpG Island)区域和一些调控区域。DNA甲基化的异常可能导致多种疾病的发生，如癌症和发育障碍等。在肿瘤细胞中，存在低甲基化的原癌基因与高甲基化的抑癌基因，因此，癌细胞拥有一套特殊的甲基化修饰模式，可以作为诊断癌症的标志物。甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前进行分子诊断，为癌症早期诊断提供了新的途径。
肿瘤甲基化特征示意图
2014年，全国恶性肿瘤新发病例数约380万例，死亡病例数约230万例，癌症已经成为患者家庭和社会医疗资源的沉重负担。对于结直肠癌，I-IV期的存活率分别为94%、82%、67%和11% [1]。在美国，从1975年到2012年，因为筛查介入，结直肠癌的发病率和死亡率下降了近50% [2]。因此，更早发现癌症，是控癌的有效手段。随着高通量测序技术近十年的发展，涌现出大量核酸相关的肿瘤标志物，例如，DNA突变，小RNA和甲基化等。其中，肿瘤甲基化标志物具有高信噪比、可溯源肿瘤类型等优势，展现出巨大的临床转化潜力。
甲基化Panel分为Bisulfite处理前建库（Pre-BS）和先进行Bisulfite转化再进行文库构建策略（Post-BS）两种设计，Post-BS在捕获前会进行PCR富集，因此，模板利用率更高，更利于捕获低丰度信号。
伯科为客户提供定制化液相甲基化芯片(Methyl-Cap)，采用Post-BS探针设计策略，对正负链均设计探针，保证更够的模板利用率，同时双链设计可进一步用于区分SNP等基因组固有信息（内参或样本区分）。
伯科甲基化Panel探索单分子甲基化信号
优势
- 适用于亚硫酸氢盐处理(Post-BS)并扩增后的文库捕获，灵敏度更高；
- 针对正负链设计探针，获得丰富的双链信息；
- 优异的捕获特异性、CpG覆盖率与均匀性；
- 偏好低，与WGBS、Roche Epigiant Panel相关性好
- 支持多文库捕获，有效提高通量、简化流程
实验流程
1、预文库构建：对样本进行亚硫酸氢盐处理，PCR富集，得到甲基化捕获预文库。
2、样本浓缩：加入需要捕获的甲基化预文库，重复序列封闭试剂、接头封闭试剂、45℃蒸干。
3、杂交：加入杂交试剂回溶，在PCR以上95℃条件下变性10分钟后，加入甲基化捕获芯片，56℃孵育16小时以上。
4、探针捕获：加入链霉亲和素磁珠捕获探针（56℃）。
5、清洗：分别使用Wash Buffer I和S进行热洗（60℃），Wash Buffer I/II/III进行室温清洗。
6、PCR富集后纯化终文库。
7、对文库进行上机测序。
产品性能
捕获区域198Kb
通过对比友商R在198Kb的甲基化芯片，对8例测试样品（4个cfDNA样品，4个gDNA样品）进行测序发现，对于cfDNA，伯科的目标区域捕获效率要高出友商R 10%左右。gDNA相比cfDNA的捕获效率高出10~20%。甲基化检测结果的相关性系数达到0.86，表明两款芯片具有较高的相关性，详情如下表及图所示
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DNA-Type
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cfDNA
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gDNA
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||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
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Capture Panel
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友商R
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伯科
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||||||
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On-Target (Base)
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23.6%
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36.9%
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34.3%
|
33.4%
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48.7%
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42.7%
|
48.2%
|
53.7%
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Average Depth
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66
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136
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137
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158
|
341
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447
|
454
|
371
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Coverage Rate
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99.8%
|
99.9%
|
99.8%
|
99.9%
|
99.9%
|
99.7%
|
99.9%
|
99.7%
|
|
4X CpG Coverage
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98.4%
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99.5%
|
99.5%
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99.8%
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99.6%
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99.5%
|
99.6%
|
99.5%
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伯科的198Kb甲基化捕获Panel与友商R在捕获效率、均一性比较
伯科甲基化捕获芯片与友商R的甲基化芯片在甲基化率的相关性系数
捕获区域500Kb
伯科定制的500Kb Methyl-Panel在On-Target(Base)区域为50%左右，覆盖均一性好，4xCpG占比在99.5%左右，目标区域片段占比随着测序深度增加呈现正态分布。以伯科的500Kb Methyl-Panel与SeqCap Epi CpGiant（80.5M区域）比较发现，两者的相关性系数达到0.982，而伯科的500Kb Methyl-Panel与全基因组甲基化测序的相关系数达到0.933。说明伯科500Kb的甲基化panel具有可靠的数据产出结果。此外，相同样品做多次的500Kb甲基化芯片得到结果是相关性系数在0.984以上，说明该芯片具有较高稳定性。
伯科500Kb甲基化捕获芯片在不同样品的均一性、与CpGiant、WGBS的相关性比较结果、捕获到样品与样品的甲基化率稳定性结果
Methyl-Cap与全基因组数据比较
伯科的甲基化Panel（捕获6357个CPG区域）与WGBS的相关性系数达到0.93，伯科的甲基化Panel（捕获3848个CPG区域）与WGBS的相关性系数达到0.89。说明伯科甲基化Panel与WGBS具有较高的相关性。
甲基化Panel与WGBS相关性
应用
大量研究表明，肿瘤细胞具有特异的甲基化模式，能够作为区别肿瘤与正常细胞的高灵敏标志物。肿瘤细胞释放的ctDNA甲基化标志物在肿瘤的无创诊断，监测、预后评估等临床应用中具有广阔前景。近年，ctDNA甲基化标志物用于癌症的早期辅助诊断和筛查，已经取得了多个重要成果。
2015年，PNAS的研究结果表明，ctDNA特异的甲基化模式，不但可用于癌症检测还能够追溯ctDNA片段的组织来源，定位肿瘤，而之前，定位肿瘤组织部位一直是泛癌早筛的主要瓶颈之一[4]；同年，《Cell Research》发表的研究表明，ctDNA甲基化在肝癌的无创诊断应用中极具潜力[5]；2017年3月，《Nature Genetics》报道了利用甲基化单倍型和组织特异信号，首次同时实现肿瘤诊断和溯源的研究[6]；同年10月，《Nature Materials》发表了采用甲基化标志物进行大规模肝癌无创诊断的研究，结果显示通过ctDNA甲基化检测可以将肝癌诊断灵敏度提高一倍[7]；2018年，《Nature》报道了基于cfMeDIP技术检测ctDNA甲基化信号的无创肿瘤诊断方法，可以对胰腺癌、肺癌等多种癌症进行早期诊断和组织溯源，再次印证了肿瘤甲基化标准物的性能优势[8]。
同年，基于液相基因芯片，通过将Post-BS建库与Post-BS捕获相结合，研究人员将cfDNA的甲基化测序深度提高了近5倍，并用于乳腺癌、结直肠癌的诊断和治疗检测，证实了甲基化液相基因芯片对微量，多位点，低丰度甲基化信号检测的技术可行性[9]。
2019年5月，美国GRAIL公司宣布，其多癌种早期检测产品已被美国FDA批准为突破性设备（Breakthrough Devices），对于全球癌症早筛领域，称得上是一个里程碑事件。
ctDNA甲基化肿瘤早筛研究进展