MLPA+Sanger+SRS+LRS | 伯科长读长靶向捕获Gene Panel助力常染色体显性多囊肾的复杂遗传病因解析
- boke
- 2024-12-03
- 5:48 下午
多囊肾病（PKD）具有遗传异质性，表现为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是最常见的成人遗传性肾脏疾病，其特征是肾囊肿逐渐增大，肾脏体积增大，最终导致终末期肾衰竭。
ADPKD主要由PKD1和PKD2基因突变引起，分别约占85%和15%。此外，例如，DNAJB11和GANAB等几个新的致病基因近年来在非典型ADPKD中被发现。此外，与ADPKD表型相似的基因，例如HNF1B和OFD1，也越来越多地被发现。
对862名健康个体血浆 cfDNA 进行片段组学分析发现，cfDNA 浓度范围为 1.61 至 41.01 ng/mL。随着 cfDNA 浓度的增加，大 DNA 片段 (231-600 bp) 数量增加，短 DNA 片段 (20-160 bp) 频率降低，同时，G末端基序频率增加。
ADPKD致病基因的分析似乎比其他单基因疾病更具挑战性。首先，PKD1和PKD2基因高度变异，PKD1包含46个外显子，编码长度为12912 bp（NM_001009944.3），跨越约50 kb的基因组区域[2]。此外，PKD1有6个假基因，序列相似度约为98%。因此，PKD1的大尺寸、高同源性、高复杂性和高GC含量导致检测该基因内的突变较为困难。此外，一些致病基因没有明显的突变热点，且表型存在重叠，使得ADPKD的基因诊断更加复杂。
为了避免意外地对PKD1假基因进行测序，使用长片段PCR（LR-PCR）扩增来生成位点特异性模板。Rossetti等人使用LR-PCR结合巢式PCR来筛查PKD1的整个区域，在所选患者中获得80%～90%的高诊断率，但成本高且费时。
尽管PKD1和PKD2中单核苷酸变异(SNV)和短插入缺失(indels)等是主要的变异类型，但也已鉴定出大的缺失和重复。多重连接探针扩增技术(MLPA)是一种有价值的技术，用于检测PKD1和PKD2基因中的缺失或重复，尤其是在PCR测序结果为阴性时。
如今，全外显子测序(WES)已成为一种强大的工具，可同时研究多个基因，在成本效益、时间节约和劳动力节约方面具有优势。然而，作为短读长测序技术(SRS)的成员之一，其固有的缺点导致ADPKD的灵敏度和特异性降低。
首先，SRS的短读长可能给准确地将基因组参考序列进行比对带来挑战，这使得区分目标基因和假基因序列变得复杂。此外，SRS可能无法检测到高GC含量和复杂结构的区域，因为这些片段的扩增比较困难。
快速发展的第三代单分子长读测序技术(LRS)可能克服SRS的一些缺点，因为它在检测基因组重排方面取得了进展，尤其是在重复或复杂的基因组区域。在长读长测序数据（通常为1000 bp或更长）中，研究人员可以方便区分目标基因与其假基因的序列，并找到准确的断裂点等。
在最近的一项研究中，研究人员利用LRS在一个ADPKD家系中发现了致病基因PKD1的转变变异，WES和MLPA曾将其误认为外显子缺失。这是首次利用LRS在PKD1基因相关区域发现致病基因转变(Gene conversion)[3]。
最初，对患者的WES检测到PKD1外显子18杂合SNV变异c.7391G>C，以及WES的CNV分析发现PKD1的第17和18外显子杂合缺失。MLPA 证实了 PKD1 外显子18的杂合缺失。但是，使用Sanger测序并未确定缺失断点，因为在琼脂糖凝胶电泳中未获得较小的片段。同时，除了c.7391G>C之外，Sanger测序还发现了PKD1外显子18中的其他4个杂合SNV变异 (c.7278T>C、c.7288C>T、c.7344C>G 和 c.7365C>T)。
Sanger测序结果与WES和MLPA结果之间的差异促使研究人员采用长读长测序（LRS）进行进一步研究。
LRS分析揭示了一个基因转变事件，涉及来自PKD1假基因的至少282 bp序列。首先，LRS 发现了7个聚集的碱基替换变异 (c.7209+28C>T、c.7210-16C>T、c.7278T>C、c.7288C>T、c.7344C>G、c.7365C>T 和 c.7391G>C)，结合LRS结果和家系共分离分析，发现这些变异位于同一条染色体上，并认为这些变异源于PKD1假基因，覆盖了至少282bp的区域。
值得注意的是，c.7288C>T的同源序列变异导致 PKD1 产生提前终止密码子，从而导致功能丧失，并根据 ACMG/AMP 指南，被归类为致病性 (PVS1+PS4+PM2)。
基因转变（Gene conversion）
基因转变是一种通过同源序列替换基因组中的等位基因来产生致病突变的机制，这已在各种人类孟德尔疾病中得到证实。尽管这种现象先前已在由PKD1引起的ADPKD中有所描述，但其确切的基因组起源和范围尚未表征。Rossetti等人最近报道了PKD1与PKD1P6重复之间的基因转变事件，跨越8.5 kb，并涉及28-32号外显子。然而，Rossetti等人使用的传统短读长测序（SRS）无法确定PSV是在反式还是顺式排列。本研究的LRS结果直接确定了PSV位于同一亲本等位基因上。当没有亲本分离分析时，此功能尤其有利。LRS独特的长读长特性能够精确地绘制连续的单倍型，将基因特异性区域与其假基因对应区域连接起来，从而准确地界定基因转变的范围。在本研究中，LRS结果显示，母本PKD1等位基因并非如先前推测的那样携带17号和18号外显子的缺失，而是经历了假基因介导的基因转变。该转变事件将来自PKD1P1到PKD1的几个变异引入，包括已知的致病突变（c.7288C>T），通过在18号外显子中引入提前终止密码子（p.Arg2430Ter）导致功能丧失。
MLPA导致Exon18杂合缺失假阳性原因
PKD1 18号外显子的MLPA探针结合区域存在SNV变异，导致了假阳性结果的出现。众所周知，连接位点附近的单核苷酸变异（SNV）会影响MLPA探针的杂交或连接，从而影响检测准确性，其影响因与连接位点的距离而异。据报道，连接位点8个碱基对以内SNV会影响MLPA探针的杂交或连接，而超过此距离的SNV的影响尚不明确。变异c.7344C>G位于左探针寡核苷酸的3’末端，导致3’末端错配，阻碍了探针扩增。变异c.7365C>T位于右探针寡核苷酸的3’末端8个核苷酸处，其影响难以预测。尽管如此，c.7344C>G变异的存在足以导致MLPA检测出现假阳性结果。
PKD1基因LRS靶向捕获测序
DNA 投入量：3 μg
片段化长度：1~6 Kb
定制化Gene Panel: PKD1、PKD2、GANAB、DNAJB11、HNF1B、PKHD1
测序平台：Pacific Biosciences Sequel IIe
该研究表明对于复杂的遗传变异，LRS等补充工具对于全面检测 PKD1 变异的重要性。
参考资料
1.C. Bergmann, L. M. Guay-Woodford, P. C. Harris, S. Horie, D. J. M. Peters, and V. E. Torres, “Polycystic kidney disease,” Nature Reviews. Disease Primers, vol. 4, no. 1, p. 50, 2018.
2. E. Cornec-Le Gall, A. Alam, and R. D. Perrone, “Autosomal dominant polycystic kidney disease,” Lancet, vol. 393, no. 10174, pp. 919–935, 2019.
3.Long-Read Sequencing Identified a PKD1 Gene Conversion in ADPKD Rather Than the False-Positive Exon Deletion Indicated by WES and MLPA. Human Mutation. 2024. https://doi.org/10.1155/2024/7225526
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