miRNA与心脏发育和心脑血管系统疾病（二）miRNA对心脏发育的调控

而在心脏发育晚期，Dicer酶则参与心室间隔生成和流出道的发育。神经嵴细胞中条件性敲除Dicer酶，对神经嵴细胞迁移、定位影响不大，但却导致Caspase依赖的细胞凋亡途径被激活，交感神经和感觉神经元缺失。miR-21以及miR-181a诱导Erk1/2信号通路上调，能调控神经嵴细胞中特异性敲除Dicer酶引起的生物效应。

Dicer酶除参与胚胎发育过程外，其对维持新生儿心脏功能和结构的完整性也十分必要。组织特异性敲除Dicer酶不会导致胚胎死亡，但却能使新生儿心脏成熟miRNA水平显著降低，导致其最终死于扩张型心肌病与心力衰竭。而成年小鼠心肌细胞特异性敲除Dicer1则会导致自发性心肌重塑。Drosha-DGCR8复合体是pri-miRNA形成pre-miRNA的关键酶，在神经嵴细胞以及心肌细胞中特异性敲除DGCR8也会出现类似的心脏畸形。

miRNA在哺乳动物的胚胎发育过程中发挥着重要作用，其对心肌细胞分化及发育也起着重要作用。

（一）miRNA对心脏神经嵴细胞发育的影响

发育早期，神经嵴细胞（neuralcrestcells，NCCs）由背神经管分离所得，形成一条略有起伏的细胞带，继而迁移分化形成外周神经系统、生黑色素细胞以及颅面组织。心脏神经嵴（cardiacneuralcrest，CNC）是来源于胚胎枕部耳板至第3体节间的一群神经嵴细胞，是由此迁移到心脏的干细胞。来源于颅脑枕部的神经嵴，与流出道、瓣膜、心脏传导系统、咽弓动脉发育等心脏形态发生过程密切相关。敲除小鼠胚胎心脏神经嵴细胞中的Dicer1会造成多重的心血管缺陷，这些异常包括双入口左心室、三尖瓣闭锁。由此可见，心脏神经嵴细胞与心脏锥干部的发育关系密切，miRNA可以干预心脏神经嵴细胞进而影响心脏发育。

多种miRNAs可以调控NCCs分化为平滑肌细胞。异位表达的miR-145可通过表达与血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMCs）分化相关的基因诱导多功能神经嵴干细胞分化为VSMCs。miR-145可促进心肌蛋白依赖的成纤维细胞转化为VSMCs。miR-143和miR-145可以通过共同靶向作用于相关转录因子，如Klf4、心肌蛋白和Elk1等，调节VSMCs增殖分化。miR-143靶向调控Elk1（促进血管平滑肌细胞增殖），miR-145靶向调控心肌蛋白（促进VSMCs分化）以及Klf4和钙调蛋白激酶Ⅱ（促进细胞增殖），调控VSMCs的分化和增殖。这些结果表明miR-143/145可能在调控平滑肌细胞的表型转换中发挥重要作用。miR-143/145双基因敲除小鼠没有表现出任何心脏和血管畸形，但新生小鼠由于主动脉和股动脉的血管中膜缺损而表现出低血压。

（二）miRNA对心外膜和心内膜细胞发育的影响

miRNA在心外膜和心内膜发育过程中的调控作用还不完全清楚。但有研究发现心外膜Dicer1对于冠状动脉血管的发育起着重要作用。心外膜Dicer1特定缺失导致小鼠出生后立即死亡，主要表型是由于上皮向间质细胞转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）受损而出现的冠状动脉血管缺陷和心外膜细胞增殖与分化降低。在这些突变的心脏中，心外膜细胞的EMT转化过程受到严重影响，并且EMT调节因子的表达也发生改变，Wt1、Snail1、Snail2和Twist1的表达减少，E-cadherin的表达增加；在冠脉血管发育中Dicer1在心外膜细胞增殖过程中显著下调。

多种miRNAs可以调节EMT的过程，其中包括miR-21、miR-31、miR-103/107、miR-155和miR-200家族。

在心外膜间质细胞中miR-21可以通过靶向程序性细胞凋亡因子（programmedcelldeath4，PDCD4）和快速发育生长因子同源物1（sproutyhomolog1，SPRY1）促进纤维化的发生。过表达miR-21也会导致间充质细胞标志物E-cadherin表达减少。

miR-31可以通过直接抑制心肌祖细胞基因Isl1，抑制上皮细胞的EMT过程。miR-23通过抑制其HAS2和细胞外透明质酸的产生抑制心内膜垫形成。

在斑马鱼胚胎心脏中，miR-23基因的表达缺失会导致心内膜垫的细胞分化。研究还发现miR-23b在孕早期室间隔缺损（ventricularseptaldefect，VSD）胚胎心肌组织中上调4.4倍，在孕中期VSD组织下调3.5倍。说明miR-23b可能调控转化生长因子β（TGF-β)、Notch、Wnt信号通路；miR-23b可以抑制鼠的内皮细胞TGF诱导的EMT过程，这提示miR-23b表达下调对于心肌细胞的成功分化是必要的。

miR-218不但可以调节血管的发育，敲除miR-218后也可以降低心脏内膜的迁移率抑制心脏发育过程。以上研究表明miRNA在心外膜与心内膜发育过程中具有重要作用。

（三）miRNA对心脏形态发育的调控

很多miRNAs被证明是心肌细胞发育的关键调节因子，对心脏的表达、发育调节以及出生后心脏功能的维持都十分重要。

miR-1是一种进化保守，且在心肌、骨骼肌高度富集的miRNA。miRNA测序显示，miR-1在哺乳动物心脏表达最为丰富，约占心脏总miRNAs的40%。研究发现，血清反应因子（serumresponsefactor，SRF）、肌细胞增强因子-2（myocyteenhancerfactor-2，Mef2）、MyoD、肌细胞生成素（myogenin）以及NKX2.5等肌源性转录因子可调控肌肉特异性miR-1。miR-1可下调Tinman（无脊椎动物中NKX2.5的直系同源基因）下游的Cdc42，这种调控关系影响新生果蝇心脏收缩、电传导和节律维持。Irx5是一个调节KCND2的同源结构域转录因子，参与心脏复极过程。有研究显示miR-1-2突变小鼠心脏电生理缺陷与其靶向调控iroquois同源盒5基因（iroquoishomeobox5，Irx5）有关。此外，有研究发现miR-1可促进心脏祖细胞和骨骼肌祖细胞的最终分化，并维持胚胎横纹肌正常发育，过表达可导致心脏前体细胞的过早分化。

敲除miR-1的心肌细胞则会出现严重的肌节紊乱，Telokin、Myocardin、Acta1、Acta2、β-MHC/MYH7等平滑肌特异性基因显著上调，并且出现心力衰竭和心室异常，进而使胚胎发育受阻。Hand2是一个与心脏分化相关的心源性转录因子。miR-1可靶向抑制Hand2的表达，显著降低心肌细胞的增殖能力，使心肌细胞过早出现周期停滞。

胚胎发育期间，miR-133a可以靶向抑制SRF和cyclinD2编码基因，对于心脏收缩基因的表达和心肌细胞增殖起着重要的调控作用，还可促使新生儿心肌细胞过早退出细胞周期。miR-1和miR-133a具有不同的序列，很可能调控不同的靶基因，从而具有不同的生物学功能。但在心脏发育过程中，两者行使的功能仍有部分重叠。

miR-17-92基因簇，亦称为OncomiR-1，是一种高度保守的多顺反子转录物。miR-17-92簇通过负调控肿瘤抑制因子PTEN来促进胚胎、新生儿和成人心脏的心肌细胞增殖。此外其对于第二生心区的心肌祖细胞的分化具有重要作用，影响右心室和流出道的正常发育。胚胎发育相关转录因子ISL-1和T-box转录因子1（T-boxtranscriptionfactor，Tbx1）是第二生心区发育的标记蛋白，这两种转录因子在第二生心区未分化的前体细胞中高表达。敲除BMP2/4，将抑制pri-miR-17-92，导致Tbx1表达下调，造成心脏发育缺陷。miR-17-92缺失引起Bim等促凋亡蛋白的上调，胚胎出生后不久就死于室间隔缺损和肺发育不全。此外，同时敲除miR-17-92和miR-106b-25将导致心室发育不良、心房和心室中隔缺损、血管充血、水肿等一系列严重的心血管疾病，严重时可导致胚胎死亡。miR-92能影响斑马鱼内胚层以及心脏二分叉（cardiabifida）的形成，而特异性敲除miR-92则引起左右心不对称。

此外，miR-17-92簇成员还参与调节器官大小。全身过表达miR-17的转基因小鼠与其同窝对照小鼠相比，体型更小；同时心脏、肝脏和脾脏重量显著降低，这可能由于miR-17抑制纤维连接蛋白的表达。然而，在小鼠发育中的心肌细胞过表达整个miR-17-92簇，导致心脏增生、肥大，并在约2月龄时引起猝死。可见miR-17-92簇的成员具有不同的功能，每个单独的miRNA在心脏发育和功能方面的调节作用仍需进一步研究。

miR-15家族表达于人类各组织器官中，其家族成员包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424、miR-497等，其可以通过抑制细胞周期调控因子来抑制心肌细胞增殖，亦可靶向抗凋亡因子Bcl-2诱导细胞凋亡。

哺乳动物胚胎形成时期，心肌细胞大量增殖，出生后随着闰盘的成熟以及肌原纤维密度的增加，出现细胞周期停滞，心肌细胞体积增大。此时多个miR-15家族成员表达明显上调，其中miR-195在此过程中变化最为明显。

miR-195可通过靶向抑制检测点激酶1（checkpointkinase1，Chek1），影响DNA修复和有丝分裂。

miR-590和miR-199a可以促进新生的和成年啮齿动物的心肌细胞增殖。miR-320通过下调热休克蛋白20的表达诱导心肌细胞凋亡。

另外miR-98、miR-128和miR-142可以直接调控TGF-βR1抑制TGF的活性，影响心肌发育，损害胚胎发育鼠的心肌细胞增殖和活性。

同时miR-15家族成员体外可直接靶向细胞周期相关的几个重要蛋白：cyclinD1、cyclinD3以及cyclinE。E2F是肿瘤抑制蛋白pRb的下游因子，可通过在细胞周期调控基因的启动子促使异染色质的形成，从而将胚胎心肌细胞维持在有丝分裂阶段。

研究人员通过研究多种肿瘤细胞发现，E2F可直接靶向于miR-15和miR-16簇。但miR-15家族、E2F与cyclinE的靶向调控关系在心脏发育中的作用，仍有待进一步实验探究。