奔跑吧，后浪！| 国产WES芯片两大测序平台的测评（上）
2021-05-20
与WGS相比，WES更像是倚天剑，精悍灵活、削铁无声。依靠较少的数据量，WES便可有效覆盖大部分基因组编码区，检测SNP、InDel变异不在话下，此外，还可以灵活添加其他区域，例如线粒体，CNV和病毒模块等，具有极高的性价比。
正因如此，WES芯片已经从科研阶段逐步进入广泛的临床实践，主要包括遗传病诊断和肿瘤诊疗。例如，通过WES构建患者个体的全外显子突变谱，在个性化肿瘤疫苗制备中，筛选更为有效的新生抗原；作为TMB检测金标准，为肿瘤免疫治疗选择提供依据；为MRD检测提供突变信息，让变异标志物的选择更加游刃有余，为肿瘤治疗方案评估、复发监控等提供更多参考。作为提前兑现肿瘤监测的MRD检测，基于全外突变谱的检测方法更具针对性，肿瘤异质性与现阶段普遍应用的肿瘤Panel相对固定的基因存在一定矛盾，很难” One Size Fits All”（图1A、B），同时，由于ctDNA检测敏感性与检测位点数量正相关（图1C、D），因此，使用全外突变谱可以间接提高MRD检测准确性。
图1. A. 50例NSCLS患者体细胞突变重合比例（TCGA）[1]。B. WES芯片检测到的突变基因与商品化Panel基因List的重合基因数量。上方Panel，10例NSCLC队列数据；下方Panel，1059例NSCLC TCGA数据；红色方框为根据WES突变谱设计的个性化Panel，蓝色方框是固定基因的商品化Panel[1]。追踪不同数量突变的ctDNA检测性能评估（C，D）[2，3]。
总而言之，不论是TMB还是MRD检测，更加全面的全外显子突变谱将更好，由于体细胞突变检测的测序深度要求较高（≥500x），测序成本需要进一步降低促进临床应用的推广。WES芯片作为全外显子突变图谱构建的统一标准也将是水到渠成，众望所归。
WES芯片由几十万条探针组成、设计与合成技术均需要大量的实验数据积累，例如，核苷酸的选择，RNA还是DNA，单链还是双链？一段180bp的目标区域，使用120nt探针头尾相连好（240nt Bait Region），还是60nt OverLap更好（180nt Bait Region），两种设计Reads覆盖特征有何区别？而这仅仅是在设计层面，因此，想要生产一款高性能WES芯片并非易事。
作为靶向捕获技术的开拓者，Agilent、Roche和IDT在过去很长一段时间引领着靶向测序前进的方向，不论是特异性还是覆盖均一性也都是行业标杆。现在，国产WES芯片作为后起之秀在性能参数方面和国际竞品相当，甚至更好。
今天，小编就为大家带来一款国产WES芯片（TargetCap Core Exome Panel v3.0）在Illumina和MGI双测序平台的测评表现，该WES芯片由伯科生物自主研发生产，由近40万条120nt ssDNA探针组成，作为WES界的“后浪”，其表现究竟如何呢？话不多说，上图。
图2. TargetCap®Core Exome Panel v3.0双平台测试实验流程
首先介绍整个实验设计，考虑到WES在全外突变谱建立中的应用，样本方面，采用含有不同突变数量的5套gDNA标准品（Set 1-5），每套标准品由不同等位基因频率的5个样本组成（0%-40%），共25例样本，按照样本质量的高低分为两类，分别为稍低质量样本（LQ，15例）和高质量样本（HQ，10例）。对上述25例样本分别构建Illumina Truseq和MGI 双端Index文库，按照5-Plex与TargetCap®Core Exome Panel v3.0杂交16h，分别在Illumina NovaSeq（ILMN）和MGISEQ-2000（MGI）平台进行150PE测序50Gb以上，随机抽取10Gb进行数据质控。
图3. 靶向测序评估参数示意图
对于靶向测序数据的评估，冗余度和中靶率决定了有效数据，即平均测序深度，而覆盖均一性则决定了有多少目标区域能够用于最终的分析，FDA所批准的全外产品Omics Core规定平均测序深度≥500x，0.2x Mean Depth≥95%（≥100x的目标区域占比）；和木桶效应一样，木桶够高还不行（平均测序深度），能盛多少水取决于最矮的木板（0.2x Mean Depth）；除了最矮的木板，还有一些木板稍高，他们就是0.3、0.4、0.5…x Mean Depth等，对于体细胞突变分析，当然是“多多益善”，即更多的区域达到更深的测序深度，因此0.3-1.0x Mean Depth的值越高越好。除此之外，还有一个评估均一性的参数叫Fold 80，计算公式为平均深度/80%以上目标区域覆盖的深度，低于2.0均一性较好，可以理解成评估整个缺口的大小。
图4. 伯科WES芯片双平台测序参数
碱基质量
ILMN平台碱基质量Q20在不同质量样本中保持一致，均为98.6%，MGI平台在总样本中为95.8%，LQ和HQ样本分别95.5%和96.1%。在碱基质量上出现样本质量相关的趋势。
数据有效性（冗余度+中靶率）
中靶率（On-Target）方面，两个测序平台无明显的差异。在冗余度方面，MGI平台：~2%，ILMN平台：~14%。
目标区域覆盖率
ILMN与MGI测序平台完全一致，达到总体99.8%，LQ 99.7%，HQ 99.9%，表现出高质量样本的覆盖率稍高于较低质量的样本。
覆盖均一性
1.低深度区域占比
0.2x Mean Depth: ILMN与MGI测序平台几乎一致（Total：99.5%/99.4%），在总体、LQ和HQ样本中，两个测序平台数据表现均较为优异。
0.5x Mean Depth: MGI/ILMN（92.9%/91.3%）两个测序平台在不同质量样本中趋势一致。
2.整体均一性（Fold 80）
MGI（1.44）与ILMN（1.55）两个测序平台在不同质量样本中趋势一致。
接下来，我们再看一看TargetCap®Core Exome Panel v3.0的稳定性，对于总体25例样本，除Duplication参数外，不论是ILMN还是MGI测序平台，其他各项参数的CV值均控制在5.1%及以下，数据表现出极佳的稳定性；其中，MGI平台Duplicaiton的平均值为2.2%，CV值为13.5%，相对较高的CV与极低的均值有关。
TargetCap®Core Exome Panel v3.0分别在两个测序平台上的数据表现令人印象深刻，覆盖率：99.8%，中靶率（碱基）：61.2-61.7%，0.2x Mean Depth：99.3-99.7%，0.5x Mean Depth：90.3-93.4%，Fold 80：1.41-1.59。对比伯科个性化定制Panel，Core Exome保持了伯科Panel的基本表现（图5）。
图5. 伯科个性化Panel数据表现
ILMN和MGI平台差异比较
MGI和ILMN测序平台在测试中展现出来的差异究其背后的技术原因，可能是来自于信号放大过程中（文库扩增），两个测序平台选择的路线差异，如图6所示，MGI采用线性滚环扩增，ILMN使用指数桥式扩增，在冗余度及整体均一性上，MGI体现出线性扩增的特征。
图6. ILMN与MGI信号放大示意图
0.2x Mean Depth
作为关键的“最矮木板”，0.2x Mean Depth在两个测序平台上几乎完全一致（ILMN 99.5%，MGI 99.4%）,但进一步分析低于0.2x Mean Depth（下文简称低深度区域）的区域（Bait）发现，低深度区域的GC分布存在明显的平台差异，在高质量样本中，ILMN平台低深度区域的GC分布相对均匀，在低GC区域有轻微的增加，而MGI平台则主要集中在高GC区域，在稍低质量样本中，这一趋势被进一步放大（图7）。小编愚见，在捕获实验中，是否增加预文库投入量，降低Post-PCR循环数以进一步提升相关表现。
图7. TargetCap®Core Exome Panel v3.0低覆盖区域的平台分布差异
综上，我们欣喜的看到国产WES芯片已经可以完美适配Illumina Novaseq与MGI-2000平台，且性能表现优异。在下篇文章中，我们将给大家带来TargetCap Core Exome Panel v3.0在不同测序平台变异检测方面的内容，敬请期待。
参考文献：
[1] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).[2] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).[3] Parsons H A , Rhoades J , Reed S C , et al. Sensitive Detection of Minimal Residual Disease in Patients Treated for Early-Stage Breast Cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2020, 26(11):clincanres.3005.2019.
