技术小贴士 | PCR是偏好之源？对Capture而言并非如此
- boke
- 2022-06-23
- 7:21 上午
上一篇文章我们介绍了基于液相基因芯片的基因靶向测序技术中，探针富集的基本工作原理（技术小贴士|探针高温变性时间对捕获的影响）。预文库构建时，通常都会经过PCR扩增，每个Unique的DNA模板都存在大量拷贝；靶向捕获过程是用过量的探针对Unique片段扩增后的大量拷贝进行富集，确保“万无一失”（图1）。
如果我们采用PCR-free的预文库进行捕获，其实是去掉每个Unique模板的副本“保险”，即Unique模板没有大量拷贝存在，探针的亲和性偏好将被放大，其模板利用率和覆盖均一性将会受到影响。那么，PCR–free预文库的靶向捕获数据如何，小编就带大家一探究竟。
图1. 杂交捕获中，原始模板(Template)、扩增后预文库(PreLib)与探针(Probe)的分子数量示意图
使用50ng DNA投入量进行文库构建，连接Truseq接头(“大Y”)，分别PCR 0、2、4和6个循环；为了更好的测试模板利用率表现，在捕获环节使用小尺寸Panel(＜50Kb)进行捕获，这样能够较快达到文库的饱和深度，同时，将不同条件的预文库全部用于捕获，并在捕获后采用相同的PCR循环数以尽可能减小实验变量。此外，为了测试提高投入量能否改善PCR-free PreLib的相关表现，我们增加了200ng DNA Input的PCR-free PreLib的条件测试（图2）。
图2. PCR-free预文库捕获测试实验设计
如图3所示，在25000x理论深度条件下进行分析，50ng PCR–free PreLib捕获数据的Duplication已经达到近80%，明显高于其他建库条件；随着PCR循环数的增加，其Duplication逐渐降低，并在4-6个循环时不再降低，证明50ng PCR–free PreLib的捕获文库丰富度低于其他条件。我们也注意到，200ng PCR-free PreLib的Duplication表现与50ng PCR 4-6个循环的条件相近，说明提高DNA建库投入量，对于在PCR-free PreLib的捕获文库丰富度提高是有帮助的。
同样，在25000x理论深度条件分析的Unique Depth表现与Duplication较为一致，50ng PCR-free PreLib捕获的目标区域深度只有PCR 4-6个循环的一半左右，也就是说，采用PCR–free PreLib进行捕获将丢失大量的原始模板。
图3. 不同数据量条件下，PCR-free和PCR预文库的捕获数据(Duplication，Unique Depth)
此外，如果采用较低的测序深度进行分析（图3. 1000x理论深度分析），虽然上述不同条件的捕获数据表现趋势较为相似，但并不能观测到PCR-free PreLib捕获严重丢失原始模板的现象。
在覆盖均一性方面，0.2x Mean、0.5x Mean和Fold80参数的表现与Duplication和Unique Depth的趋势一致。不同的是，提高投入量后，虽然200ng PCR–free预文库的文库丰富度明显改善（图3），但在均一性方面，200ng Input并未明显提高其捕获覆盖均一性，50ng与200ng Input的表现相近（图4），说明对于50ng Input的PCR-free预文库，覆盖较差的区域即使提高投入量也效率有限，至少提高4倍至200ng是这样。
图4. 25000x理论深度条件分析PCR-free和PCR预文库的捕获均一性
综上所述，通过PCR增加原始模板的“拷贝副本”，可以有效提高捕获环节的模板利用率和覆盖均一性，因此，对于液相基因芯片捕获而言，常常产生偏好的PCR反而是“有益”的，特别是对于起始量较低，同时需要测序较高深度的样本，比如cfDNA。
