积跬步、至千里 | 伯科WES均一性“黑科技”揭秘
2021-08-13
2020年9月，伯科生物科技有限公司（以下简称为“伯科”）宣布已经完成首款全流程国产DNA探针人全外显子捕获试剂盒TargetCap® Core Exome Panel v3.0研发和测试，正式推向市场。
经过大量的测评工作，由伯科自主研发生产的全外显子Panel，TargetCap® Core Exome Panel v3.0，其性能表现得到了众多用户的高度认可，尤其是覆盖均一性方面。如图1所示，在测序500x的情况下，Core Exome Panel v3.0在不同测序平台上都能达到1.4左右的Fold 80。有用户表示，该均一性已经超过诸多国外竞品，大大超出预期。
图1. TargetCap® Core Exome Panel v3.0在高深度测序下的均一性表现。
覆盖均一性是靶向测序最重要的参数之一，它决定了有多少目标区域能够达到分析要求。换言之，高均一性能够减少测序数据量，节约成本（图2A）。
如图2B所示，使用伯科TargetCap® Core Exome Panel v3.0进行捕获分别在Illumina和MGI平台测序，在测序7.5Gb时（92/101X），≥20X以上的目标区域占比达到99.6%；5Gb测序时（61/68X）, ≥20X以上的目标区域占比仍然超过98%，远高于国标《GB/T 37872-2019》规定的80%。
图2. 高均一性可有效节约测序数据量。
那么，如此优秀的均一性是怎么做到的呢？
接下来，小编和大家聊一聊TargetCap® Core Exome Panel v3.0的开发中用到的一些“黑科技”。
影响覆盖均一性的因素有很多，其中目标区域GC含量最为关键，通过对低/高GC区域的局部探针浓度调整可以优化Panel的覆盖偏好。但除了GC含量，还有一个鲜为人知的关键因素——探针补偿效应。伯科研发团队对引起覆盖偏好的因素进行聚类分析时发现，目标区域所覆盖的探针数量的多少与其覆盖深度正相关，也就是说探针之间的侧翼补偿效应会引起覆盖偏好，其原理如图3所示。
图3. 探针侧翼补偿效应产生覆盖偏好示意图。
按照目标区域覆盖探针数量的多少，伯科团队把目标区域分为低、中、高补偿区（L-FLK、M-FLK和H-FLK），分别对~1.5万条探针组成的Panel进行统计，如图4所示。目标区域的覆盖深度与其探针数量正相关，也就是说，长短不一的目标区域会因为覆盖探针的多少产生天然的深度差异，其与GC偏好一样，是影响Panel覆盖的重要因素。
图4. GC含量和探针补偿效应对覆盖深度的影响。
那么，调整L/M/H-FLK这3种区域的局部探针浓度，能否改善Panel的覆盖偏好呢？为验证这一假设，研发人员合成了L/M/H-FLK区域探针不同浓度配比的Panel，并进行捕获测序。如图5所示，浓度配比2#的三个区域之间的覆盖差异最小，数据表现最优，与比例1#相比，Fold 80降低0.1（SNP等位基因频率并未受到影响），证明探针补偿效应也是影响覆盖均一性的重要因素，调节补偿效应区域探针浓度是优化Panel均一性的有效手段。
图5. 调整不同探针补偿区的探针配比对覆盖均一性的影响。
在此基础之上，对GC偏好区域的探针局部浓度进行调整，也能使Fold80降低0.1，进一步表明探针补偿效应是独立于GC的覆盖偏好影响因子（图6）。
图6. 调整不同GC含量目标区域探针配比对覆盖均一性的影响。
综上所述，针对覆盖偏好的关键影响因子探针补偿效应和GC含量，调整对应的探针浓度，可以明显改善Panel的覆盖均一性（图7）。
图7. 由伯科生物自主研发的覆盖偏好优化技术原理示意图。
在WES Panel的开发过程中，除了使用伯科独创的局部探针浓度调整技术，TargetCap® Core Exome Panel v3.0还采用伯科自主知识产权的专利生物素修饰。分别采用伯科生物素与常规生物素分别制备Core Exome Panel v3.0，并进行捕获测序。结果显示，与常规生物素相比，伯科生物素能够进一步提升覆盖均一性（图8）。除此之外，通过加入多种小分子化合物，伯科自主研发的杂交试剂能够进一步降低GC偏好。
图8. 伯科生物素与常规生物素修饰的Core Exome Panel v3.0比较。
综上所述，从杂交试剂、探针修饰/合成/设计、探针局部浓度调整等多方面测试优化调整，所谓“积跬步至千里“，每一步1%的提升积累，使得TargetCap® Core Exome Panel v3.0的覆盖均一性在众多竞品中脱颖而出。同时，伯科将继续努力，打磨技术，精益求精。
