原创性技术平台创造价值，基因芯片中国制造
2019-12-05
今天，随着精准医疗快速的发展，寡核苷酸芯片（Gene Panel）已经成为了合成生物学的重要应用之一；在生殖、遗传疾病、肿瘤诊断、肿瘤早筛等医学与健康领域发挥着至关重要的作用。伯科生物医学科技公司是“中国制造”尖端高通量核酸合成技术创新者，拥有国内独家的高通量核酸合成与修饰技术，致力于建立从寡核苷酸、DNA/RNA序列片段到染色体基因组成和构建的全流程合成生物学平台。
图1：伯科已完成27款液相芯片的设计及合成，应用于NGS、Nanopore平台，包括DNA、RNA和甲基化等多种芯片。
目标区域捕获测序技术作为精准医疗领域中重要的分子诊断手段，已经得到临床的广泛认可，而多基因Panel已经逐步成为临床的主流。基因Panel的设计与合成，是一个对合成工艺要求极高的技术，目前主要被海外的核酸合成企业垄断，合成周期与成本以及产品性能难以满足快速增长的科研、临床需求；令人欣喜的是，通过对合成、修饰技术持续创新、严格把控合成质量并不断提升芯片设计性能，伯科基因芯片已经打破这种垄断局面，为建设国内基因芯片的合成标准而持续努力。
一、极速合成、性能卓越
目前，伯科已经能够高效、稳定的合成长达150nt的寡核苷酸，伯科基因芯片采用生物素修饰的120 nt 单链DNA探针，其中，拥有自主知识产权的创新型生物素修饰，可以调节空间位阻，在提升探针与DNA的亲和能力和减少非特异结合方面具有独特的优势。伯科芯片适用于二代和三代测序平台，可应用于基因组、转录组和甲基化的多组学研究。目前，伯科已经为多家用户提供了近30款基因芯片，合成时间均控制在7-15个工作日内、真正兑现本土化优势，加速相关领域的科研和临床转化（图1）。伯科的探针可以覆盖多平台、多种类型；除了基因组捕获，伯科的转录组、甲基化等基因芯片，也得到了用户的充分认可。
数据表现
图2：伯科基因芯片优异的捕获表现
在精准、稳定的合成平台和高性能探针设计软件的支撑下，伯科基因芯片的捕获数据表现非常稳健，如图2所示，对于大小从80Kb到~2Mb的DNA-Cap Panel， On-Target均大于60%，覆盖均一性方面，0.2 X Mean Depth大于99%，0.5X Mean Depth大于93%，比肩并在部分参数指标上超越友商产品。值得一提的是，在与友商产品的比较测试中，伯科芯片在特异性、均一性等多个参数上，均表现出明显优势。
友商产品对比测试（测试数据均由用户提供）
① NGS ~1.5 Mb DNA-Cap Panel vs. 友商 R
图3：伯科与友商R的同款Panel在NGS平台上的综合比较（数据均为比例呈现）
伯科在7个工作日内完成探针合成，在快速交付的同时也能保证优异的捕获性能。针对伯科和友商R的同款Panel分别对3种不同的样本类型进行捕获测序，结果显示在捕获特异性上，两种Panel表现相似，无明显差异；覆盖均一性上，在0.2 X Mean Depth时二者表现相近、而当到达0.5 X Mean Depth时，较友商R高出近10%，优势明显；同时，深度分布也显示，伯科Panel的深度分布更为集中、均匀。即在覆盖均一性方面伯科Panel表现更为优异（图3）。
② Nanopore ~4 Mb DNA-Cap Panel vs. 友商 T
图4：伯科与友商T的同款Panel在Nanopore平台上的捕获特异性比较（数据均为比例呈现）
众所周知 Nanopore测序在CNV/SV变异、Repeat Region以及病毒整合等方面的检测中具有明显优势，由于读长更长，Nanopore的基因芯片设计也完全不同于NGS，伯科针对三代平台捕获开发了相应的探针设计软件。目前，已经成功完成3款DNA-Cap Panel的设计合成，以其中一款~4Mb Panel为例（图4），在与友商T的比较测试中，伯科Panel的捕获特异性是友商T的~2.7倍，表现突出；同时，伯科Panel也保持着良好的均一性。综上，在Nanopore测序平台上，伯科Panel的捕获特异性完全超越友商T。
二、立足品质、贴近需求
图5：探针合成和设计是芯片性能的保障
基因芯片产品的开发涉及多学科交叉融合，包括物理、化学、生物学、数学等多个学科的综合应用。具体而言，产品性能的高低主要由两方面决定：
1）探针的合成质量，包括生物素修饰效率，碱基错误率、探针拷贝数均一性等；
2）探针设计，例如目标区域是否全部覆盖，探针覆盖区域大小、探针特异性如何等等。
它们共同决定了基因芯片产品的数据表现，其评估参数又包括数据冗余度（Duplication）、目标区域覆盖率、捕获特异性（也称为中靶率、On-target）、覆盖均一性（Uniformity）等等。
这些指标是保证最终临床检测的高准确性和低成本的基础（图5）。因此，伯科将完备的探针质量保障体系建立和高性能探针设计软件开发作为主要突破口，不断提升芯片性能；同时，从核酸杂交的物理/化学原理出发，为不同检测需求提供多种解决方案。
1.全面质控体系
图6：伯科探针质控体系技术流程示意图
质量控制是产品性能的根本保障，也是企业生存和发展的生命线。根据自身合成平台特点，针对探针的生物素修饰效率/稳定性、碱基合成准确性、探针完整度等参数、伯科巧妙的利用多种分子生物学技术和检测平台，建立了行之有效的质控流程，为产品质量提供了有力保障（图6）。例如，基于自主研发的单链DNA PCR-Free建库流程，使用多种合成标准品和多个人类基因组标准品的测序数据作为基线进行校正，并与捕获参数建立相关性，从而对探针拷贝数均一性和完整度参数进行质控。
图7：伯科Panel捕获质控流程和报告示意图
同时，伯科将对合成后的DNA-Cap Panel进行捕获测序（NGS/Nanopore），为客户提供详尽的捕获测序质控报告（图7）；值得一提的是，在今年年底，针对不同类型的Panel，伯科将使用多种标准品全面升级捕获质控流程，为用户提供更为深入的产品性能检测。
2.高性能探针设计软件
图8：伯科探针设计软件开发流程示意图
基于自主的高通量合成平台，伯科将一轮研发测试压缩至7天左右，在大量原始捕获数据中，通过机器学习对多参数进行计算机模拟和实验验证（图8），以更高的数据有效性和检测灵敏度为目标，综合考虑目标区域GC含量、探针侧翼效应、杂交解链热动力学特性、序列复杂度、特异性等参数并结合基因变异特征，建立了一套高性能探针设计软件，适用于DNA、RNA、甲基化、病毒捕获等各种模块，可以为用户提供详细与完整的生物信息分析和基因芯片探针设计。
3.以应用为导向、满足临检需求
图9：A、伯科体系短时间杂交的数据表现，4h杂交是特异性和均一性的平衡点，杂交时间越长，非特异结合越多，On-target越低，但覆盖均一性越好，并在4h左右稳定；B、提高挑战区域检测灵敏度的途径，包括加入探针修饰、增加探针多样性与文库插入片段长度以及补充突变型探针等。
短周期、高通量是杂交捕获技术近阶段发展的重要方向，快速杂交体系与简捷、稳定的杂交流程是实现前两点的基础，例如，1h或者更短的杂交时间，对温度更加耐受的清洗体系等等；此外，进一步提升挑战区域的检测灵敏度也是临床应用之急需，比如，短片段和/或多突变样本（cfDNA、FFPE）的InDel、Fusion检测具有挑战性，其根本原因是核酸片段之间亲和力下降，难以杂交同时更容易被清洗。伯科也正在开展针对性的研发工作，希望从探针设计、修饰合成、杂交试剂优化等方面进行优化，为用户带去完整的解决方案。
图10：伯科体系短时间杂交的数据细节，对于80 Kb的DNA-Cap Panel，杂交1-16 h，特异性逐渐降低[64%（1hr）、61%（4hr）、59%（16hr）](A)、均一性逐渐增加[0.5X Mean Depth，95.3%（1hr）、97.0%（4hr）、98.0%（16hr）]；其中，均一性指标在4h达到稳定，与16h表现相似，符合预期（B）。进一步分析与肿瘤靶向治疗相关的基因位点（6基因、58个位点）的测序深度，杂交1h和4h时，上述位点深度相近，均稳定分布在0.8-1.5 X平均深度的区间内（C、D）
需要强调的是，对于挑战区，通过捕获表现或覆盖深度并不能准确判断检测灵敏度；因此，虽然测试数据显示，短时间杂交对小Panel的基本捕获表现以及重要区域的覆盖度并不会产生较大影响（图10），但是对于具体的突变Calling仍然需要进一步实验验证，特别是液体活检中InDel、Fusion等变异检测。
图11：A、根据用户提出的1X+2X Tiling方式进行设计合成，捕获测试数据显示，2X Tiling区域的覆盖深度符合预期；B、按照用户提供的2个区域的Bed文件，伯科设计并合成~100条探针，按照探针摩尔数1：1的比例将上述探针Spike-in到~1Mb的原始Panel中，捕获数据显示，原始区域覆盖得到明显改善，符合预期。
在完善探针性能的同时，为了满足临床科研的开发与转化，伯科还推出了个性化Tiling（图11A）、探针模块化定制化服务，例如加入融合检测、免疫组库、病毒整合或其他“基因补丁”等模块（图11B），最大限度满足产品开发需求，为临床分子诊断提供更多解决方法。
三、结语
精准医疗的大幕刚刚拉开，伯科将针对科研、临床需求，全面深化技术研发，包括多修饰探针的高效合成、智能化生产线完善、针对多场景的探针设计软件整合、适用于极速杂交/自动化捕获实验体系的开发以及加强杂交体系的基础研究等方面的工作。伯科希望通过近年积累的合成经验，努力促进基因芯片合成的规范化、标准化，与行业同道一起，尽快建立基因芯片领域的制造标准，为精准医疗和国人健康保驾护航。
