DNA/甲基化共检测 | 基于“半保留”复制的“镜像“捕获技术Methyl-SNP-seq
- boke
- 2022-11-18
- 7:07 上午
来自肿瘤的ctDNA具有多种特征，包括DNA基因组层面的序列变异，片段化特征以及表观层面的甲基化/羟甲基化修饰差异等。在测序过程中，甲基化检测需要将修饰信号转化为碱基信息，比如亚硫酸氢盐（BS）处理后，5mC不变，而C变化为T，检测到C to T的碱基改变，则判定为非甲基化，仍然检测到C，则认为是带有5m修饰。这种检测方式将带来一些局限性，1）对于多态性位点（SNP）或没有参考基因组的甲基化检测，较难区分究竟是序列本身已经突变还是甲基化修饰的差异（图1）；2）血液中cfDNA含量有限，将有限的样本分DNA建库和甲基化建库进行不同的检测，操作较为繁琐；3）靶向甲基化检测通常需要同时捕获正负链信息以及针对甲基化与非甲基化修饰状态，探针设计较为复杂。因此，迫切需要一种可以同时检测DNA和甲基化信号，而且方便下游开展捕获富集检测的技术。
图1 BS-Seq中Genetic variants与Methylation status的Calling策略以及Double strand bisulfite sequencing (DSBS)技术对此的改进[1]
近日，《Genome Research》报道了一项新颖的DNA/甲基化共检测技术，“Methyl-SNP-seq reveals dual readouts of methylome and variome at molecule resolution while enabling target enrichment”，该技术利用发卡接头（HairPin adapter）和切刻平移（Nick Translation）技术，保留原始碱基信息，在甲基化转化后结合针对基因组设计的DNA-Panel，可以同时靶向检测DNA和甲基化信号。
如下图所示，对DNA进行末端修复、dA Tailing，连接发卡接头，发卡接头上含有一个U碱基，经UDG处理后出现一个切刻，使用dATP, dGTP, dTGP和5-methyl-dCTP进行延伸，并在延伸到另一端的切刻时停止（图2，2|nick translation），形成另一端的平末端，随后进行dA Tailing，然后连接Illumina Y接头（甲基化修饰），再进行亚硫酸氢盐转化，最后进行PCR富集得到预文库。这样，通过5mC的保护，原始链的碱基信息在“复制链”中得以保留，下游检测可以直接测序或通过基于基因组设计的DNA Gene Panel靶向捕获测序（Targeted Methyl-SNP-seq）。
图2 Methyl-SNP-seq建库流程示意图[2]
对于基因组变异检测，Methyl-SNP-seq与WGS的整体一致性达到98%；在甲基化检测中，Methyl-SNP-seq或Targeted Methyl-SNP-seq与WGBS的相关性也非常理想。
Methyl-SNP-seq是一个单独的实验，比分别进行WGBS和DNA seq更为方便。此外，通过保留基因组碱基的完整性，Methyl-SNP-seq可以与用于靶向富集的常规探针Panel兼容。虽然研究团队尚未针对低投入量优化Methyl-SNP-seq流程（2μg Human DNA），但根据他们使用大肠杆菌基因组DNA的测试来看（20ng Input），这个技术是具有潜力的，为DNA/甲基化的共检测提供了新的思路。
伯科生物自主研发的100%全流程国产化基因捕获平台（TargetCap®），适用于多物种、多组学以及不同测序平台（二代/三代测序）的基因靶向测序研究，已经为国内外100多家的医学检验机构、30多家知名医院与临床学术团队开发了400多款液相基因芯片（Gene Panel），在基因组、转录组、甲基化组及病原体液相基因芯片均有成熟的产品。
