近万例样本Target Cap®捕获技术表现
- boke
- 2022-05-20
- 7:00 上午
首先我们看看高温处理时间对探针完整度的影响。将探针在95℃条件下分别处理0、2、5、10、20和30min，经变性胶检测，与不处理探针相比（0min），95℃变性2min时就可以观测到弥散片段出现。弥散程度随着处理时间逐渐增加。
那么探针受到这种程度的破坏，对于捕获表现是否有影响呢?接下来，用预文库独立变性10min后加入探针作为对照，对预文库和探针共同变性0.1-2min后进行杂交并测序。结果显示，2min以内的探针变性均未明显影响捕获的基本表现，各方面参数与对照相似。
图1 高温处理的探针对捕获表现的影响
为什么探针受高温变性，捕获表现没有明显影响？
在杂交捕获过程中，模板和探针都是相对过量的，可以理解为“双保险”。首先，预文库构建时，通常都会经过PCR扩增，每个Unique的DNA模板有几十或是几百倍以上的拷贝；按照120bp长度对人类基因组进行划分（3Gb），每个120bp区域的基因组占比为120bp/3Gb=0.00000004。按照500ng的预文库杂交用量，预文库的总摩尔量（120bp Insert+120bp Adapter）约为3200fmol，基因组每120bp区域的片段加上文库接头部分的摩尔量为0.00000004*3200fmol=0.128amol（含扩增后的拷贝）。杂交捕获时，120nt探针用量为400amol each。对于每120bp区域的目标序列，探针与目标预文库的比例为3120倍。所以，靶向捕获其实是用过量的探针对Unique片段扩增后的大量拷贝进行富集，保证“万无一失”。
图2 杂交捕获中，原始模板与探针的分子数量示意图
所以，在预文库和探针均过量的条件下，一定程度的DNA损失不会对整体的捕获性能产生明显影响。此外，在极短时间的高温变性条件下（0.1min）,其捕获表现也基本正常，可能是由于杂交缓冲液中含有DMSO，甲酰胺等化学变性试剂，并且处于弱碱性环境，所以，DNA更容易解链的缘故。
有一种情况比较特殊，如果我们采用PCR-free的预文库进行杂交，其实是去掉一个模板副本的“保险”，即Unique片段没有副本存在，那么，探针的亲和性偏好将被放大，表现出整体的覆盖均一性明显降低以及冗余的增加。
最后，我们的小伙伴在研发实验时，发现刚杂交上的PCR仪故障，或是断电，或是核对实验发现少加了一部分探针，这时候可以根据上文介绍的结果和原理进行灵活处理。
