融合基因整体解决方案
应用背景
融合基因检测对临床诊疗和预后均有着重要意义，常作为肿瘤的分子标志物。然而融合位点常发生在具有大量重复区域的内含子上，而重复区域内的探针设计是捕获的难题。
为了增加覆盖密度，CNV Panel (DNA-Cap)加入重复区域探针后，中靶率从70降低至50%；而ROS1的Intron31添加至CDx Panel (DNA-Cap)后，中靶率从60降低至40%，均导致Panel测序成本增加明显。因此，对于DNA-Cap Panel的融合热点的覆盖大多以牺牲融合检出为代价，减少或者直接去掉相应的覆盖区域，再或者是通过反义DNA封闭off-Target区域，但是这些方法均有不足。
相比于在DNA水平检出融合位点，利用RNA-Cap对两个基因外显子连接的融合位点进行基因融合检测是更优的选择。随着RNA测序(RNA-seq)技术的出现，基于RNA生物分子在诊断、预后和治疗各种疾病(包括癌症和传染病)方面的应用前景也越来越广阔。
为更好实现在RNA水平上检测融合基因，伯科依托高通量核酸合成以及自主知识产权的生物素修饰技术，开发商用融合基因检测Panel-Target Cap® Solid Tumor Fusion RNA-Cap Panel。为更精确定位融合位点，伯科专门针对探针进行跨Exon-Exon方式设计，对目标转录本设计多重叠瓦排布探针(图1)，显著提高融合检出能力，还可用于检测可变剪切变异以及转录本的表达量等。
优势
Target Cap® Solid Tumor Fusion RNA-Cap Panel优势
1）较内含子区域更小，成本更低
2）较mRNA-seq对FFPE样本耐受度更高
3）捕获过程进一步去除rRNA污染，有效数据率更高
4）高灵敏度，避免内含子重复区干扰，并应对低表达的融合基因或正常细胞转录本的稀释
5）多基因检测，具有发现新的融合亚型的能力
6）同时检测多基因的“宽度”可以有效节约诊断时间
7）良好的技术拓展性，快速更新迭代，适应临床需求
方案推荐
临床样本通常尺寸有限，在进行病理检测后，往往只留下了FFPE样品。FFPE的RNA质量也通常较低，片段化程度较高，mRNA抽提效率低，影响测序结果准确性，而去核糖体方法又会残留较多含有内含子的未成熟mRNA中间体，导致有效测序数据有限，基于杂交捕获的RNA-Cap技术可以克服上述问题。
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预文库构建方法
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样本类型
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RNA建库投入量
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杂交方式
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每个样本预文库投入量
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杂交时间
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测序平台
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测序模式
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总RNA建库，离子打断
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FFPE RNA
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500ng
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3-Plex
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167ng
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16h
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MGI-2000
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PE100
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如下图，对于检测结果能够达到与DNA检测或qPCR一样的效果，且在转录本的均一性、不同区域捕获占比达到相对较高的一致性，具有可靠的稳定性。
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捕获芯片
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样本
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测序数据(Gb)
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On Target Ratio
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平均深度
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平均深度
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平均深度
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|---|---|---|---|---|---|---|
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PET PC 1#
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CCDC6
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RET
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＋
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＋
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＋
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✔
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PET PC 2#
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KIF5B
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RET
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＋
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＋
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＋
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✔
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PET PC 3#
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KIF5B
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RET
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＋
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＋
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＋
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✔
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方案应用
DNA&RNA共捕获变异检测
目前伯科生物已完成多款RNA-Cap的设计与合成，并助力用户开发DNA/RNA共捕获技术。DNA-Cap虽然可以检测多种基因的融合，但是融合基因的断点常常位于内含子的重复区中，难以设计探针。以ROS1为例，DNA-Cap对其融合热点区域覆盖只能达到52%，而RNA-Cap则可100%覆盖。
因此，在将DNA-Cap和RNA-Cap整合为共捕获流程后，操作简便，可以对SNV、Indel、
Fusion等多种突变类型进行检测，同时进行基因组与转录组相互验证，结果更加准确；此外，还可以进行组织溯源和分子分型。如图4-7所示，DNA&RNA共捕获流程较单独使用DNA-Cap时，融合基因检测灵敏度更高。在基因表达量分析方面，该流程与RNA-seq也表现出极高的相关性。
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Sample/Fusion
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DNA-Cap
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qPCR(RNA)
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DNA&RNA-Cap
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|---|---|---|---|
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1#/ALK
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❌
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✔
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✔
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2#/ALK
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❌
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✔
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✔
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3#/ALK
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✔
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✔
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✔
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4#/ALK
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✔
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✔
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✔
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5#/ALK
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✔
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✔
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✔
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6#/ALK
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✔
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✔
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✔
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7#/Negative
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-
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-
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-
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肿瘤新抗原预测
尽管以免疫检查点抑制剂类药物为代表的新兴肿瘤治疗方法取得了前所未有的突破，然而，这些疗法仍然有一些不足之处。例如，免疫检查点抑制剂类药物的受益人群有限，CAR-T疗法仅在血液肿瘤中疗效显著。
作为真正的个性化治疗方案，基于肿瘤新抗原的肿瘤疫苗展现出令人振奋的潜力。一项针对黑色素瘤的临床试验数据显示，在接受疫苗的6位患者中，4位患者在两年后没有出现复发迹象。另外2名患者在复发后使用PD-1抗体药物治疗后获得了完全缓解。
癌细胞携带大量有别于正常细胞的基因突变（DNA），在转录（RNA）、翻译后会出现许多新的突变型蛋白，称之为肿瘤新抗原，再将这些新抗原通过MHC呈现在肿瘤细胞表面，从而引导免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤，达到治疗癌症的效果。因此，准确的筛选，鉴定基因突变与表达是开发肿瘤疫苗的前提。通过DNA测序获得突变信息后，根据上文提到的优势，再利用RNA-Cap进行测序分析可以获得更为丰富、准确的基因表达信息。
