Science | 完整解析LDLR基因错义变异的功能图谱，为HeFH患者的精准诊疗奠定坚实基础
- boke
- 2025-12-04
- 5:32 下午
一、研究背景
杂合子性家族性高胆固醇血症（Heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）是一种常见且严重的遗传病，主要特征是血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平过高。约80%的确诊HeFH病例是由LDL受体（LDLR）基因变异引起的，这种变异破坏了LDLR正常清除血液中LDL的功能，导致LDL堆积，极大增加早发性动脉粥样硬化性心血管疾病的风险。鉴定致病性LDLR变异有助于实现精准诊断，并能在标准脂质谱分析之外提供预后评估和治疗管理依据，同时通过级联筛查，有望识别出更多高危亲属。然而，目前大多数LDLR编码区变异缺乏明确的临床分类，这限制了HeFH的早期诊断及患者风险分层的开展。
二、研究方法
构建覆盖全长的LDLR变异文库
采用改良POP Code法，针对LDLR蛋白860个氨基酸位点分别设计NNK简并引物，构建覆盖约17,200种可能氨基酸替换的cDNA文库。
Fig. 1 （A）实验流程概述；（B）表型筛选。
细胞模型与高通量功能筛选
使用HeLa细胞系，通过CRISPR-Cas9敲除内源性LDLR，并利用Bxb1整合酶系统将LDLR变异cDNA文库稳定整合至基因组中，实现单细胞单变异表达。
通过流式细胞荧光分选技术（FACS）法对以下两个关键功能指标进行定量筛选
（1）LDL内化能力：使用pHrodo Green标记的LDL颗粒，其在包涵体中荧光增强，定量检测LDL摄取能力。
（2）细胞表面LDLR蛋白丰度：用流式细胞术进行检测。
功能评分与验证
通过比较筛选前后各变异barcode的丰度，计算每个变异的功能评分（Functional Score），评分范围-0.5至1.5，致病变异多集中在低分区（≤0），良性变异多在高分区（≥0.5）。
三、研究结果
LDLR序列-功能图谱构建与验证
本研究检测了16,677个（97%）可能的LDLR错义变异在LDL摄取方面的功能影响，以及16,105个（94%）变异在细胞表面表达水平的影响，并建立LDLR功能评分体系，范围-0.5至1.5。
多项分析验证了该数据集的整体质量，功能评分结果显示：
（1）无义变异与同义变异的评分分布存在显著差异（P<0.001），与预期一致。
（2）错义变异的评分呈双峰分布，说明部分变异会导致LDLR功能丧失，部分变异对功能无影响。
（3）在UK biobank和All of Us队列中，降低LDL摄取能力的替换变异在高次要等位基因频率区间分布较少，与预期分布一致。
Fig. 2 (D) LDLR功能评分分布；(E) 功能分数，作为lgMAF(次要等位基因频率)的衡量标准。
序列-功能图谱与生物化学机制的关联
LDLR的配体结构域包含7个LA模块（LDL Receptor A-type Module，LA），传统上被认为是功能相似的重复单元，通过与ApoB100（LDL的主要结构成分）相互作用促进脂蛋白清除。
研究结果发现LA3、LA4、LA5、LA7对ApoB100（LDL主要结构成分）结合至关重要，其关键残基（如半胱氨酸、酸性Ca+ 配位残基、芳香族残基）对替换高度敏感。LA1、LA2、LA6替换变异在LDL摄取实验中表现出较高的耐受性，说明其在与ApoB100结合中作用有限。
Fig. 3 功能评分，用于测量LDLR中所有可能的氨基酸替换对LDL摄取的影响。
结合结构生物学数据，LA3–5和LA7与ApoB100的β-带紧密结合，而LA1、LA2和LA6结合较弱或未解析。
Fig. 4 功能评分捕捉LDLR-ApoB100相互作用的原子水平细节
在加入过量外源VLDL的条件下，LA2和LA6中部分原本耐受的变异表现出LDL摄取能力下降。这表明LA2和LA6可能在VLDL结合或竞争性抑制中发挥作用，不同LA模块在结合不同脂蛋白亚型时存在功能分工。
Fig. 5 LDLR配体结合域（LA 1 ~ 7）中所有可能的氨基酸替换变异的功能评分。（上）LDLR细胞表面丰度；（中）不含VLDL（-VLDL）的LDL摄取；（下）含4:1过量VLDL（+ VLDL）的LDL摄取。
除LA模块外，序列-功能图谱还捕捉到了其他已知的生物化学特征。例如，被认为介导受体构象变化的β-螺旋结构域对替换变异敏感；LDLR的跨膜结构域对极性残基替换高度敏感。细胞质尾部NPxY基序的破坏（该基序是受体-配体复合物内化所必需的）也会损害LDL摄取功能。
LDLR功能评分的潜在临床应用
（1）致病性变异的鉴定
在ACMG/AMP遗传变异分类系统下，本研究校准了各功能评分对应的致病性概率，为7287种LDLR错义变异提供了功能证据，其中包括约括约400种目前注释为意义未明变异，有望极大地促进这些变异的重新分类。
Fig. 6 功能评分为临床变异分类提供了证据。
（2）功能评分在HeFH风险量化中的潜在临床应用
功能评分能有效区分HeFH风险。携带破坏性变异的个体患HeFH的风险极高（OR=21.9，95% CI：14.4-33.2），与已知致病变异携带者相当（OR=22.5，95% CI：16.7-30.4）；而携带正常评分变异的个体风险则很低（OR=1.3，95% CI：1.1-1.5），低于所有 LDLR 变异体携带者的总体风险（OR=1.6，95% CI：1.4-1.8），且与携带良性变异体（良性或可能良性）的参与者风险相当（OR=1.3，95% CI：1.1-1.5）。
即使在已知的致病变异携带者中，功能评分也能进一步进行风险分层。相较于所有致病性变异体携带者，携带破坏性评分致病性变异体的个体HeFH风险约高4倍（OR=44.3，95% CI：27.4-71.5），而携带正常评分致病性变异体的个体风险较低（OR=10.5，95% CI：6.0-18.3）。结果表明，定量功能评分可补充现有变异体致病性注释，更精准地推断HeFH风险。
Fig. 7. 功能评分有助于HeFH风险的量化。
（3）功能评分在HeFH诊断中的潜在临床应用
为进一步推动实验结果向临床转化，基于荷兰临床脂质网络(Dutch Lipid Clinic Network，DLCN)诊断标准，研究者提出：功能评分≤0.04可作为“功能性突变”的阈值，其对应5%的假阳性率。在UK Biobank中筛选出携带罕见LDLR编码区变异体的参与者，应用此阈值，可将UK Biobank中符合明确HeFH诊断标准的携带未注释变异个体数量增加10倍以上，显著提高了诊断率。
每一项明确的变异体分类均可支持级联筛查，有望识别出更多高危亲属（约50%的一级亲属和25%的二级亲属），并降低其患心血管疾病风险。
Fig. 8. 功能评分有助于HeFH临床诊断。
（4）预测HeFH相关表型的潜在价值
基于UK Biobank数据，功能评分与血脂异常表型显著相关，包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高（P=0.01）和降胆固醇药物的使用（P=0.02）。进一步分析了血管健康和心血管疾病相关标志物，发现与携带正常评分变异体的参与者相比，携带破坏性变异体的参与者发生主动脉瓣狭窄（OR=2.1，95% CI：1.2-3.7）或颈动脉内中膜厚度处于高五分位数（OR=2.2，95% CI：1.1-4.3）的风险更高。
Fig. 9. 功能评分与血脂异常表型显著相关。
（5）功能评分与多基因风险评分（PRS）联合应用
研究首次在大规模人群中系统展示了LDLR功能评分与PRS在风险预测中的协同作用。结果显示PRS与LDLR功能评分在预测高脂血症和冠心病风险中具有累加效应：同时携带功能丧失型LDLR变异和高PRS的个体，其高脂血症和冠心病风险最高，且发病年龄更早
Fig. 10. LDLR功能评分与PRS在风险预测中的协同作用。
（6）跨人群适用性
在更具种族多样性的All of Us队列中重复分析，得到了与UK Biobank一致的结果，在种族和祖先背景多样化的人群中，LDLR 功能评分仍具有改善HeFH风险推断的潜力。
Fig. 11. 基于LDLR变异功能评分和多基因风险评分推断All of Us参与者表型。
四、研究意义与局限性
研究意义
（1）本研究建立了科学、可靠的LDLR功能评分体系，可精准区分LDLR基因变异的致病性，明确了配体结合域和EGF-A结构域是变异的高风险区域，关键位点（如E228、D217、R3558等）的变异可通过破坏配体结合、受体内化等过程导致LDLR功能缺陷。
（2）LDLR功能评分与HeFH的发病风险、血清LDL-C水平及降脂治疗响应密切相关，可作为HeFH精准诊断、风险分层和治疗方案优化的分子标志物，显著提升HeFH临床诊疗的精准度。
（3）功能评分结合多基因风险评分（PRS）能更准确地预测HeFH发病风险，为遗传咨询和个性化治疗提供依据。
局限性
（1）检测依赖于cDNA，未涵盖非编码变异体，也未捕捉编码变异体在剪接等方面的影响。
（2）细胞表面丰度检测中，某些替换变异可能恰好构成了检测抗体所识别的表位，从而影响了检测结果。
（3）检测中使用的细胞模型为HeLa细胞，无法完全模拟LDLR发挥作用的生理条件。
（4）仅评估了LDLR的两种功能，而LDLR可能还通过其他机制影响动脉粥样硬化。
五、总结
该研究通过构建LDLR基因近乎完整的错义变异功能图谱，系统揭示了其不同结构域对氨基酸替换的敏感性差异。基于大规模人群队列数据，研究证实功能评分与变异在人群中的频率呈显著负相关，并成功将定量功能数据转化为符合ACMG/AMP指南的临床证据强度，为超过7000个变异（包括约400个VUS）提供了分类依据。另外该研究将功能评分与多基因风险评分（PRS）相结合，能进一步改善高胆固醇血症的风险推断。
序列-功能图谱既再现了已知的生物化学机制，又提供了新的功能见解，同时为临床变异解读提供参考，为HeFH患者的精准诊断、风险分层和个性化管理奠定了坚实基础。
参考文献
1. Tabet R D , et al.The functional landscape of coding variation in the familial hypercholesterolemia gene LDLR.[J].Science (NewYork,N.Y.),2025,eady7186.DOI:10.1126/SCIENCE.ADY7186.
2. Zschocke J, Byers PH, Wilkie AOM. Mendelian inheritance revisited: dominance and recessiveness in medical genetics. Nat Rev Genet. 2023 Jul;24(7):442-463. doi: 10.1038/s41576-023-00574-0. Epub 2023 Feb 20. PMID: 36806206.