综述| 非翻译区域变异在孟德尔疾病中的作用（下）

非翻译区（UTRs）位于基因的蛋白质编码序列两侧。5′ UTR和3′ UTR序列通过线性结构和结构元件介导转录后调控，控制RNA的稳定性、细胞定位和蛋白质翻译速率。5′ 和3′ UTR内的变异已被证明可以通过多种不同的机制导致疾病。

然而，为了使这些变异能够常规地注释和解释在临床遗传检测中，我们需要更好地了解这些区域及其中的致病变异谱。在本综述中，我们系统地评估了先前在UTRs中识别出的孟德尔致病变异，并列出了其潜在机制。随着基因组测序的广泛应用和越来越多地应用于诊断环境，本综述将为考虑和解释UTR变异提供宝贵资源。

启动子是DNA中启动基因的转录的序列。相关的蛋白质，称为转录因子，它们与启动子基序结合来启动转录。启动子通常跨越基因的TSS，这也标志着5′ UTR的开始。因此，启动子下游的部分也可能与5′ UTR重叠。

在两个无关家系中观察到的BRCA1的5′ UTR-重叠启动子区域的变异（NM_007294.4:c.107A > T）与通过等位基因特异性启动子甲基化导致的表观遗传沉默相关，并认为可能导致3级乳腺癌或高等级卵巢癌。然而，另一项研究对此却提出了质疑：作者在更大规模的 BRCA1 等位基因特异性启动子甲基化患者队列中寻找这种变异，但没有发现这种变异。另一个例子是报告重叠MERTK基因的TSS变异（NM_006343.3:c.125G > A），被假设破坏转录，改变二级结构并导致遗传性视网膜病。并在体外实验中发现mRNA水平降低，支持这一猜想。

mRNA是一种单链RNA序列，能够通过自身互补碱基配对折叠并形成二级结构。这些结构可以通过干扰核糖体扫描效率和降低mRNA稳定性来影响翻译。当mRNA链折叠并与相邻部分配对时，存在几种类型的二级结构，包括pseudoknots、G-四联体和发夹结构（也称为茎环）。仅根据序列预测mRNA的确切构象和结构是困难的，并且二级结构通常是动态的。

铁响应元件（IRE）是研究最深入的茎环结构之一，它影响铁稳态相关的mRNA的翻译。细胞对铁的摄取必须严格调控，因为铁的不足或过量都可能造成损害。mRNA的5′ 帽附近的一个保守的IRE茎环被铁调节蛋白1或2（IRP1/IRP2）结合。IRP的结合通过阻止核糖体进入5′ UTR来抑制翻译起始。IRPs通过直接与细胞质中的铁相互作用来调节铁的可用性。L-铁蛋白结合并储存细胞中的铁。高铁蛋白血症/白内障综合征（HHCS）是由L-铁蛋白（FTL）基因5′ UTR中的IRE突变（例如NM_000146.4:c.- 164C > T）引起的，该变异阻止了其与IRPs的相互作用，导致L-铁蛋白产生水平失调性升高。

另一个涉及改变mRNA二级结构的例子是一个位于ADAR1基因的5′ UTR中的杂合子变异（NM_001111.5:c.60A > G），该变异降低基因表达，并被报道可引起对称性遗传性色素沉着病。这个变异似乎不会破坏该区域已知的任何调控特征；然而，这种单核苷酸变化被认为足以改变mRNA的结构。这种结构变化如何导致基因表达降低目前尚不清楚。

SEPN1相关肌病包括四种常染色体隐性遗传病。SEPN1产生硒蛋白，这对于正常肌肉发育是必需的。所有硒蛋白的一个独特特征是存在氨基酸硒半胱氨酸，它非常规的由CDS终止密码子UGA所编码。这种UGA的重新编码是通过一个高度保守的茎环结构实现的，该结构从CDS UGA密码子下游6个碱基处开始，位于3′ UTR中。这个区域被称为硒半胱氨酸插入序列（SECIS）。一个SECIS RBP（SBP2），它结合SECIS，对于将UGA重新定义为硒半胱氨酸密码子至关重要，防止在UGA处终止。在UGA处终止会触发NMD并导致蛋白质不足。有3种变异（例如NM_020451.3:c.*1107T > C）与SEPN1相关肌病有关，因为它们干扰SBP2的结合，显著降低mRNA和蛋白质水平。

精确的CDS起始密码子周围的上下游序列决定了从AUG翻译的强度以及产生的蛋白质量。5’UTR中的变异，如果破坏了Krizak共识序列，可能会影响疾病风险。Nicole等人最近的一篇论文描述了RARS2（NM_020320.5:c.2T > C）5′ UTR中的一个变异，该变异改变了CDS起始密码子的Kozak序列，减少了蛋白质产量并导致小脑发育不良（PCH）。作者还评估了ClinVar中其他预测会改变CDS Kozak序列的变异，发现有20个，其中大部分被标记为未知意义的变异。他们得出结论，这类变异可能是被低估的疾病机制。

对于大多数编码蛋白质的基因，pre-mRNA的3′ 端通过转录过程中的连续切割和加poly(A)反应形成。这是一个广泛研究的现象，由Curiinha等人进行综述，并在本文中总结。3′ UTRs含有一个加poly(A)位点（PAS），它指导在转录的后期阶段添加数百个腺嘌呤残基，形成polyA尾巴。polyA尾巴在mRNA的出核、翻译和稳定性中起着重要作用。特定PAS在pre-mRNA中的使用受RNA顺式元件和多个转录因子调控。最重要的顺式元件是polyA信号，一个位于PAS上游约~10-35碱基对的六聚体（通常是AUAAAA或其类似物如UAUAAA）。

多种影响多聚腺苷酸化的变异与疾病相关。例如，NAA10基因的PAS区（例如NM_003491.4:c. *43A＞G） 内的几个变异已被与X连锁的microphthalmia综合征相关。体外研究表明，这些变异会破坏切割和多聚腺苷酸化，导致mRNA水平降低。相反，F2基因 3′ UTR末端的一个功能获得性单核苷酸变异（NM_000506.5:c. *97G＞A ）会导致凝血酶原血浆水平升高。野生型多聚腺苷酸化切割信号效率低下，但变异增加了切割位点识别、增加了3′ 端处理、mRNA积累和蛋白质合成，导致血栓形成。

尽管不是严格的3′ UTR变异体，但一个改变α珠蛋白（HBA1）CDS终止密码子从UAA到CAA（NM_000558.5:c.427T > C）的单核苷酸变异体，允许翻译核糖体进入3′ UTR。这与α珠蛋白mRNA半衰期的显著降低有关。进一步的实验阐明，存在富含α的区域与α复合物相互作用，该复合物包含防止mRNA降解的蛋白质。α复合物被认为可以保护poly(A)尾巴并稳定mRNA。如果这种相互作用被阻止，例如在本例中，poly(A)尾巴会加速缩短；mRNA会过早降解，从而导致α地中海贫血。

miRNAs是非编码RNA，长度约为22个碱基，包含一个或多个发夹环。它们参与RNA沉默和基因表达的转录后调控。miRNA与mRNA上的互补序列配对，通常在3′ UTR内，可以沉默并抑制蛋白质的产生，例如通过mRNA去腺苷化和去帽化。

存在多个miRNA内部的致病性变异，特别是在负责介导mRNA结合的“种子区域”内。此外，3′ UTR内的miRNA结合位点变异可能会破坏miRNA介导的调控。例如，COL4A1基因3′ UTR中一个7碱基区域的变异（例如NM_001845.6:c.*31G > T）消除了miR-29 miRNA的结合位点，导致COL4A1 mRNA水平升高，进而引发脑小血管病。相反，REEP1基因 3′ UTR中miR-140结合位点的两个变异（例如NM_001371279.1:c.808C > T）预测会抑制miRNA对翻译的影响，导致REEP1蛋白水平降低，导致遗传性痉挛性截瘫31型。

在此，我们系统地回顾了5′ 和3′ UTR中重要的调控元件，这些元件在受到扰动时可能导致孟德尔疾病。这些区域在历史上一直被忽视，但随着基因组测序在临床诊断测序中的发展和应用，而现在UTR区域的序列信息正变得更加容易获取。近期关于临床解释非编码变异的建议有助于在临床环境中对UTR变异进行分类；不过，注释和解释这些变异仍然是一个相当大的挑战。

注释UTR内的变体目前需要使用一系列生物信息学工具和数据集。每个工具可以根据特定的假设效应注释变体，例如，UTRannotator，但并没有单一方案能够结合所有已知的调控元件和变异机制。每个变异可能也有多个预测效果，例如，创建一个uAUG并改变转录调控因子结合位点。在没有广泛的功能性表征的情况下，确定一个变异如何调节蛋白质表达的效果可能会很困难。

目前，UTR变体通常根据已知的调控元件进行注释；然而，这些元件可能注释不完整，尤其是如果它们是时空特异性的。此外，可能还存在通过变异介导其效应的、尚未知的调控元件类别。这通过据报道导致疾病的UTR变异得到强调，这些变异通过未知机制起作用。一个例子是VMA21基因的3′ UTR中96个碱基的缺失，它与X连锁过度自噬性肌病（XMEA）相关联，并已被证明可以减少mRNA数量。其潜在机制尚不清楚，但可能涉及mRNA的降解。

解读UTR变异体，尤其是非编码变异体的关键挑战在于，它们通常具有不完整或低度表型的效应。此外，这些效应可能朝两个方向，导致蛋白质水平增加或减少，如上文中详细描述的许多变异体所示。例如，MEF2C中的“uoORF创建”变异会降低蛋白质表达，而THPO 5′ UTR中的变异会增加蛋白质表达，两者均导致相应的疾病。蛋白质表达增加或减少导致疾病阈值高度基因特异性，但这些阈值对于大多数基因而言是未知的。对于引起疾病的部分效应非编码变异体，它们可能导致较轻的表型，例如，KLHL40 CDS中的变异与严重的肌萎缩侧索硬化症相关，而KLHL40 5′ UTR中的变异与较轻的疾病形式相关。此外，引起疾病的部分效应非编码变异还可能导致疾病发病较晚和/或降低疾病外显率。

UTR变异的解释也因需要考虑更广泛的序列背景而变得复杂。UTR是具有精确调节元素组合的复杂调节元件。与观察到的增强子中的冗余相似，其他调节元件如果其中一个元件被基因变异破坏，也可能起到补偿作用。例如，在miRNA结合位点，可以在同一3′ UTR内发现同一miRNA的多个结合位点。在解读5′ UTR变异对翻译调节的影响时，考虑更广泛的序列背景同样至关重要。例如，并非所有上游起始密码子创建的变异都是相同的：从上游起始的翻译可能性不仅取决于与Kozak共识的周围序列匹配，还取决于其他翻译的uORF的位置。例如，如果起始点位于广泛翻译的uORF内，它将不会被扫描的核糖体“看到”，因此不会对下游CDS翻译产生任何影响。

考虑到UTR变异解释的挑战，功能特征化非常重要。除了对患者在实验中观察到的单个变异效应进行解码的实验外，大规模多联测试变异效应在变异解释方面具有巨大潜力，并且有助于我们更深入地了解基因调控。然而，值得注意的是，UTR中的变异可以通过多种不同的机制起作用：影响转录、RNA加工、RNA稳定性和翻译。除非在实验中捕捉到所有这些机制，否则不能排除变异的影响。另外，如果一种检测侧重于下游影响，如细胞活力，作用的确切机制可能仍然不明确。此外，如上所述，UTR作为完整的功能元件，包括整个序列在其原生环境中可能是准确功能表征的关键。

5′ 和3′ UTR的变异是罕见但未被充分认识的孟德尔遗传病的病因。在临床环境中注释和解读这些变异具有挑战性，但可为患者提供诊断，从而增加我们对UTR介导的基因调控的了解。

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