2010-2022年 | 低频突变特异性富集技术进展回顾（四）- 与NGS结合的方法
- boke
- 2022-11-29
- 7:07 上午
低频突变能够提供重要的诊断或治疗信息，包括癌症、产前诊断、传染病和器官移植等领域。由于低频突变的丰度低，常常会被大量存在的wtDNA（wild-type DNA）淹没，较难检测，而wtDNA提供的信息又非常有限。
因此，自20世纪90年代初以来，低频突变特异性捕获检测技术（简称mutEnrich技术）开始发展，特别是随着用于癌症残留病灶监测、治疗耐药性检测以及早期癌症检测的液体活检相关研究的深入，迫切需要实用、有效、能够用于检测临床相关低频突变的mutEnrich技术，随着方法学优化和新技术的出现，mutEnrich技术的检测性能也正在得到持续的改进和优化。
2022年10月，《Clinical Chemistry》发表mutEnrich技术的综述文章，来自哈佛医学院和Broad研究所的科学家们回顾了2010年以来的mutEnrich技术[1]，并将mutEnrich技术分三个类别（PCR Blocker、Enzymatic、Physicochemical以及与NGS技术的结合）进行了系统总结。下面结合综述内容，为大家介绍与NGS技术结合的相关技术进展。
最初，突变富集与NGS结合的概念验证是通过基于扩增子的测序与基于COLD-PCR的富集相结合来进行的[2]。这种方法被设想为用于克服NGS中的突变“噪音”问题，并通过较浅的测序深度来检测低水平变异，有效降低测序成本；与传统方法扩增子NGS相比（检测限1-2% VAF），COLD-PCR NGS测序能够准确检测0.04% VAF的突变。基于PCR Blocker类的突变特异性富集技术（COLD-PCR、BDA等）在不同应用中进一步证明了该类技术具备更经济的捕获低频突变的能力[3-5]。
图1 COLD-PCR用于克服NGS背景“噪音”[2]
另一方面，在过去10年NGS的发展过程中，分子标签“纠错”技术的进步显著减少了背景“噪音”问题，也在一定程度上降低了使用突变富集来提高NGS准确性的动力。分子标签“纠错”技术使用来自正义和反义DNA链信息的组合来克服聚合酶错误并提高突变检测的准确性[6]。
然而，基于分子标签进行纠错需要超高深度测序保证不同分子标签双链都被充分读取，成本仍然较高，这限制了其在较大的Panel中使用，如果想要在更大的Panel中使用分子标签纠错技术，结合突变富集技术可以有效降低测序成本。最近的研究表明，将大规模杂交捕获与突变富集技术相结合，为目标大小与保真度困境（“breadth-vs-depth”）提供了一种独特的解决方案。
传统上，基于杂交捕获的高通量测序使用长探针（比如120nt）同时捕获突变和野生型DNA片段，长链探针具有极好的突变耐受能力，单个碱基错配对探针与片段结合力影响较小。相反，MAESTRO技术（Minor Allele Enriched Sequencing Through Recognition Oligonucleotides）使用了短链探针[7]，这与DEASH技术（DNA enrichment by allele-specific hybridization）非常类似[8]，而且MAESTRO还是在没有使用DEASH的“竞争性阻断剂”的情况下运行，可以视作DEASH技术的升级版本。
图2 DEASH与MAESTRO工作流程[9]
MAESTRO使用短的突变特异性探针（20-40nt）来识别和富集多达10000个突变等位基因，然后将其与“分子标签”测序相结合。这种方法通过从DNA文库中捕获含有突变的分子，从而在一个步骤中实现靶向和突变特异性富集，其中正义链和负义链都具有分子标签条形码，然后再进行“最大效率”的“双链”测序。MAESTRO克服了高测序深度要求和测序成本之间的矛盾，同时保持了测序的准确性，为同时跟踪众多肿瘤特异性罕见突变提供了强大而准确的方法。
图3 BDA技术原理示意图[10]
总而言之，由于液体活检领域的需求不断增长，在过去十年中出现了几种改进突变富集和检测的新技术，包括使用新原理的方法，或为适应新需求而对先前技术进行升级的方法，使其能够达到不同检测平台的LOD，例如，如Sanger测序或实时PCR。它们为NGS测序平台提供了更加经济的检测极其罕见变异的能力。数字PCR原则上不需要富集来检测突变的微滴，前提是可以筛选足够多的微滴。然而，实际上，在大多数商业平台中，液滴的数量是有限的，从而限制了LOD[11]。对于含有足够突变拷贝的DNA样品，在ddPCR之前应用突变富集技术，可以产生更多数量的含有突变DNA的液滴，当原始VAF接近ddPCR极限时，可以提高结果的可信度[11]。总之，突变富集技术提供了提高低频突变丰度的实用工具。
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