2010-2022年 | 低频突变特异性富集技术进展回顾（三）- Physicochemical方法
- boke
- 2022-11-25
- 7:07 上午
低频突变能够提供重要的诊断或治疗信息，包括癌症、产前诊断、传染病和器官移植等领域。由于低频突变的丰度低，常常会被大量存在的wtDNA（wild-type DNA）淹没，较难检测，而wtDNA提供的信息又非常有限。
因此，自20世纪90年代初以来，低频突变特异性捕获检测技术（简称mutEnrich技术）开始发展，特别是随着用于癌症残留病灶监测、治疗耐药性检测以及早期癌症检测的液体活检相关研究的深入，迫切需要实用、有效、能够用于检测临床相关低频突变的mutEnrich技术，随着方法学优化和新技术的出现，mutEnrich技术的检测性能也正在得到持续的改进和优化。
2022年10月，《Clinical Chemistry》发表mutEnrich技术的综述文章，来自哈佛医学院和Broad研究所的科学家们回顾了2010年以来的mutEnrich技术[1]，并将mutEnrich技术分三个类别（PCR Blocker、Enzymatic、Physicochemical以及与NGS技术的结合）进行了系统总结。除了PCR Blocker或酶学法的突变富集方法外，最近出现了采用物理化学方法进行突变富集的技术（表1）。在这些方法中，热力学原理、基于链霉亲和素磁珠的液相捕获或光化学被用于低频突变的选择性放大。
表1 理化类低频突变特异性富集技术（Multiplexity：Low 1-5/Moderate 100/High 1000 Targets）
一种基于热力学的低频突变鉴别方法采用了“SuperSelective”引物进行qPCR，该引物由三部分组成：较长的5′-锚定序列（anchor）、桥序列（bridge）和短的3′-foot序列[2]。较长的5′-锚定序列强力的结合在靶区上游，而桥序列与模板链不互补，短的3′-foot序列长度仅为6至8nt，与突变等位基因完全互补，因此与野生型等位基因形成了错配。在这种结构中，桥序列形成一个“单链泡”，以分离5′-锚定和3′-foot序列。区分突变和野生型序列的热力学原理是短的3′-foot序列与野生型杂交的稳定性远远低于foot/突变序列（完全互补），因此野生型模板不太可能被扩增；其原理与MEMO技术类似，但不需要添加额外的Blocking Primer。“SuperSelective”引物提供了一种低成本、灵敏、定量的富集和检测方法。
图1 “SuperSelective”引物技术原理示意图[2]
基于链霉亲和素磁珠的液相捕获技术的使用也在促进富集技术的发展。DISSECT技术（Differential Strand Separation at Critical Temperature）是多重PCR与液相捕获相结合的技术[3]，首先通过多重PCR扩增目的扩增子，然后再利用30nt 野生型生物素探针与之结合，在临界温度下，突变DNA/野生型探针无法稳定结合，释放后可被优先扩增，野生型DNA则保持在链霉亲和素磁珠上。根据序列背景，DISSECT可以在单管中富集探针区域内的任意位置的突变，无需先验获知突变信息，最多可达400倍富集。
图2 DISSECT技术原理示意图[3]
相反，也可以使用链霉亲和素磁珠富集突变片段，比如基于MALDI-TOF质谱的UltraSEEK[4]，UltraSEEK为突变富集和检测提供了一种多重、快速和操作友好的方法，但是其选择性相对较低，也需要特殊的仪器。另一种是基于biotinylated pyrrole-imidazole (PI) polyamides（生物素修饰的吡咯-咪唑聚酰胺）的捕获技术[5]，它利用发夹PI聚酰胺与B-DNA的小沟结合识别并捕获突变序列，其中Py/Py（pyrrole）配对识别A-T或T-A碱基对，Py/Im（imidazole）和Im/Py分别识别C-G和G-C碱基对（β-alanine替代Py以改善长链曲率），这种基于PI polyamides的新型富集方法可以有效富集cfDNA中的特定变异，但只能局限于某些序列，影响了其广泛应用[4、5]。
图3 Biotinylated PI polyamides捕获技术原理示意图[5、6]
最近，出现了一种采用了紫外线（UVA，365nm）辐射介导的光化学交联来去除过量wtDNA的新型富集方法。如图4所示，UVME技术（UV-mediated cross-linking minor allele enrichment）含有一对常规PCR扩增引物，一对含有光敏分子的寡核苷酸探针（CNVK Probe），CNVK Probe分别封闭正义链和负义链，其中封闭正义链的探针针对靶序列区域，与野生型等位基因完全互补，与突变等位基因形成错配不能正常退火，而封闭负义链的CNVK Probe针对非靶序列区域，作为common封闭探针，对突变不具有区分性。CNVK Probe均位于扩增引物的3’端，在UV介导的交联后，野生型DNA的正义链以及野生型和突变型DNA的负义链均不能扩增，仅有突变型DNA的正义链可以作为模板延伸扩增，进而实现突变模板的选择性富集。UVME技术可以应用在PCR前（pre-PCR-UVME）和/或在PCR过程中有效封闭野生型DNA，展现出极大的灵活性和高达800倍的突变富集，为已知突变检测提供了一种灵活、经济、有效的富集技术，并具有高多重性富集的潜力，当然，UV处理导引入的碱基突变也同样值得关注[7]。
图4 UVME技术原理示意图[1、7]
综上所述，在低频突变特异性富集技术中，基于理化方法的技术包括利用热力学原理的“SuperSelective”引物特异富集、基于链霉亲和素磁珠的液相捕获（DISSECT、UltraSEEK和PI polyamides捕获技术等）和光化学交联的UVME技术等，为低频突变特异性富集检测提供了更多的选择以及可能的开发方向。
伯科生物研发团队自主开发的SynStar21多功能Oligo合成仪，硬件和软件系统可以满足分子检测、核酸药物开发等不同应用方向的DNA和RNA序列合成需求。在理化法低频突变特异性富集检测应用中，SynStar21多功能Oligo合成仪可以提供常规PCR引物、短链（30nt）和长链（120nt）生物素修饰探针等核酸合成。
