2010-2022年 | 低频突变特异性富集技术进展回顾（一）- PCR Blocker 方法
- boke
- 2022-11-15
- 7:07 上午
低频突变能够提供重要的诊断或治疗信息，包括癌症、产前诊断、传染病和器官移植等领域。由于低频突变的丰度低，常常会被大量存在的wtDNA（wild-type DNA）淹没，较难检测，而wtDNA提供的信息又非常有限。
因此，自20世纪90年代初以来，低频突变特异性富集检测技术（简称mutEnrich技术）开始发展，特别是随着用于癌症残留病灶监测、治疗耐药性检测以及早期癌症检测的液体活检相关研究的深入，迫切需要实用、有效、能够用于检测临床相关低频突变的mutEnrich技术，随着方法学优化和新技术的出现，mutEnrich技术的检测性能也正在得到持续的改进和优化。
2022年10月，《Clinical Chemistry》发表mutEnrich技术的综述文章，来自哈佛医学院和Broad研究所的科学家们回顾了2010年以来的mutEnrich技术[1]，并将mutEnrich技术分三个类别（PCR Blocker、Enzymatic、Physicochemical以及与NGS技术的结合）进行了系统总结。结合综述文章，我们对PCR Blocker技术部分进行介绍。
表1 PCR Blocker类低频突变特异性富集技术（Multiplexity：Low 1-5/Moderate 100/High 1000 Targets）
PCR Blocker方法是阻断wtDNA扩增，特异扩增突变型DNA的方法，比如通过野生型特异的Oligos阻止DNA聚合酶在wtDNA上的延伸。如图1所示，与wtDNA序列完全匹配的PCR Blocker能够阻止DNA聚合酶的延伸（Stoffel聚合酶不具有链置换活性），而由于突变型DNA模板存在突变，其与PCR Blocker存在碱基错配，PCR Blocker不能与之有效杂交，DNA聚合酶可以正常延伸[2]。
图1 WTB-PCR工作原理 (WTB，Wild-Type blocking)，Blocker含有10个LNA碱基和GGG DNA碱基序列，GGG是三个错配碱基，防止Blocker作为引物延伸[2]
PNA（Peptide nucleic acid）和LNA（locked nucleic acid）杂交探针是较为常用PCR Blocker，例如，8碱基DNA（TGCTGGTG）的Tm为35℃，而相应的LNA序列的Tm为71℃。DNA的单碱基对错配使Tm降低10℃，而LNA的单碱基错配的ΔTm达到26℃(图3)。早期PCR Blocker技术的局限性包括有限的多重性（Multiplexity）以及Blocker的经济性等，经过十余年的发展，PCR Blocker技术已经得到明显优化。
图2 LNA、DNA和RNA结构，LNA具有更好的碱基错配区分能力[3]
COLD-PCR
COLD-PCR是一种利用错配杂交mut/wt和完全杂交wt/wt之间小的Tm差异，通过控制变性温度来抑制完全杂交的wt/wt模板解链，来达到抑制wtDNA扩增的技术（图3），1）94℃变性；2）降温至70℃，让DNA模板杂交，形成错配双链（mut/wt）和无错配双链（wt/wt）条件下；3）升高温度至86.5℃，使得错配双链（mut/wt）解链而无错配双链（wt/wt）仍然维持杂交状态；4）55℃条件下，引物与解链的mut/wt模板退火；5）72℃延伸，并循环上述PCR流程。
图3 COLD-PCR技术原理示意图[4]
COLD-PCR扩增过程中，错配双链（mut/wt）被优势扩增，但仍然含有部分的wtDNA模板。如图4所示，在此基础上，Ice-COLD-PCR技术通过加入过量的与wtDNA正义链完全互补的RS Oligos（Reference Sequence），更加彻底的封闭wtDNA，提升突变DNA的扩增占比，LOD (%VAF)为0.1-0.5。
图4 Ice-COLD-PCR技术原理示意图[5]
Ice-COLD-PCR技术的限制包括1）需要对变性温度进行精确控制2）Multiplexity较低3）扩增片段的长度限制。eICE-COLD-PCR[6]技术的出现，进一步克服了上述不足。eICE-COLD-PCR技术的RS Blocker含有少量LNA碱基，增加了错配双链与无错配双链之间的Tm值差异，进而减少了对变性温度控制的依赖，在成本可控的条件下，eICE-COLD-PCR较Ice-COLD-PCR具有更好的变异富集效率，LOD (%VAF)达到0.01-0.1。
图5 eICE-COLD-PCR技术原理示意图[6]
Oligoribonucleotide interference-PCR，ORNi-PCR
ORNi-PCR 技术通过ORN（17-29碱基的短RNA）与互补wtDNA序列杂交，抑制跨wtDNA的PCR扩增（图6）。ORN（RNA）较LNA成本更低，而且不需要3’封闭修饰，因此更加经济，同时ORNi-PCR还具有便于设计、操作简单的优势[7]。
图6 ORNi-PCR技术原理示意图[7]
此外，针对引物结合进行干扰的特异扩增技术也得到了长足的发展，包括MEMO (3′-modified oligonucleotides), BDA (blocker displacement amplification)以及BM PCR (branch migration-based selective PCR)等。
MEMO/BDA/MB-PCR
MEMO技术基于链置换原理，包括一对常规引物和一条阻断引物（3’封闭，不能延伸），阻断引物与野生型等位基因序列完全匹配，同时与常规引物中的一条有3个或以上的部分碱基重叠（overlap引物），阻断引物与overlap引物的用量比例为5:1。因此，阻断引物对于野生型等位基因具有更高的Tm值和浓度，其自身有3’端封闭，不能延伸，但阻挡了overlap引物的正常结合；突变型等位基因和阻断引物存在错配，overlap引物可以正常结合并延伸扩增。当需要在靶区内富集特定突变时，MEMO是一种经济且易于设计的技术。MEMO允许对短靶序列进行操作，这对于不同质量的DNA样品是有利的。
BDA与MEMO原理相近，其阻断引物与overlap引物重叠6-14个碱基。每个靶点的重叠数量由综合热动力学因素精确设计，不但能够准确识别变异位点，还具有更好的温度耐受性，为该方法提供了稳定的多重突变检测能力[1、9]。MEMO和BDA方法显示出优异的低频突变富集性能力，LOD (%VAF)达到0.01-0.1 [1]。另一种基于PCR阻断的方法是BM-PCR（10），BM-PCR使用与overlap引物重叠1-4个碱基的阻断引物。上述技术为低频突变特异性富集提供了有效、经济的解决方案[1]。
图7 MEMO技术原理示意图[8]
综上所述，PCR Blocker低频突变特异性富集技术可以分为两类，一类是通过wtDNA Blocker（阻断剂）封闭wtDNA后抑制引物结合来实现（MEMO/BDA/MB-PCR等）；另一类是通过wtDNA Blocker（阻断剂）封闭wtDNA后抑制聚合酶延伸来实现（COLD-PCR/ ORNi-PCR等）。
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