让辅助生殖技术（PGT-M）惠及更多患者| 伯科靶向长读长Gene Panel助力动态突变精准检测
- boke
- 2024-12-24
- 3:14 下午
多核苷酸重复扩展突变相关疾病是重要的神经遗传病之一，包括亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调、脆性X综合征等，多核苷酸重复扩展突变是这类疾病的病因。
脊髓小脑共济失调-36（SCA36）是一种遗传性神经退行性疾病，属于脊髓小脑性共济失调的一种亚型，由20号染色体20p13上的NOP56基因内含子区域GGCCTG六核苷酸重复序列的杂合性重复扩展引起。
超过临界阈值的重复扩张会导致疾病，并且可能在世代间增减，这是动态突变的根源。对于SCA36，无病个体通常携带3-14个重复序列，而有症状个体则携带650-2500个重复序列。
在medRxiv 预印本上发表的一项研究中[1]，中国研究团队提出了一种新的方法，该方法整合了更新的数据、使用贝叶斯方法的95%置信区间和靶向长读长测序技术，以准确检测动态突变的重复序列扩增，从而为SCA36及类似疾病提供最新的致病范围。
研究背景
诊断动态突变，不仅要观察临床症状，还要做辅助检查，基因检测尤其重要。诊断取决于在特定致病范围内检测到动态突变的数量。
如果突变数量在定义范围内，则可以诊断；否则，结果为阴性。但在确诊和排除范围之外，还有一个意义不明确的范围。目前，主要通过临床诊断来评估这个不明确范围。如果临床诊断明确，这个不明确范围就认为是阳性；如果临床表现无法关联，则认为是阴性。
但临床中经常遇到表型不明确，基因检测结果也在不明确范围内的情况。这尤其对胚胎植入前遗传学检测（PGT）候选人构成伦理挑战，因为伦理委员会可能根据指南不批准后续程序。
目前，PGT主要包括三个子类技术，胚胎植入前单基因遗传学检测（PGT-M）、胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）和胚胎植入前染色体结构变异遗传学检测（PGT-SR）。
PGT-M是针对单基因遗传疾病的，旨在避免父母遗传特征影响胎儿。PGT-M为有单基因遗传疾病的夫妇提供了生育健康后代的机会，但伦理要求非常严格。这是因为目前医学研究对基因变异与临床表现的关系理解不足，基因-疾病关联研究不够完善。因此，采用严格的纳入标准以最大限度地减少脱靶效应，从而避免出生缺陷胎儿。
具体来说，PGT-M只能在明确的致病范围内使用，而不能用于重复扩张的不确定范围；因此，准确定义基因检测中重复扩张致病的明确范围，将为更多不确定范围内的患者提供PGT-M支持。
研究方法
通过对相关文献进行了全面回顾，并收集了2012年以后的检查数据。使用伽马分布描述数据分布，并应用贝叶斯方法将来自近期发表论文的数据更新到先验分布。基于重新校准后的分布，使用95%置信区间（CI）确定新的致病范围下限。收集家系数据，并通过靶向长读长测序（LRS）验证了该方法，以检测高GC含量和长重复序列。
研究结果
基于两项研究的结果，表明伽马分布很好地描述了数据分布。在SCA36致病性重复扩增的综合研究中，95% CI内的先验、似然和后验分布分别为446以上，124以上和484以上。这些重新校准后的致病范围通过一个确诊病例得到了验证：通过靶向LRS检测验证，一位被诊断为SCA36的患者携带418个重复序列，她的女儿携带499个重复序列。
SCA36患者的PGT-M伦理标准严格限定在特定致病阈值内。严格的标准导致一些致病性不明确的SCA36患者无法接受PGT-M。
SCA36重复扩张次数在14到650之间时，患者可能不会表现出明显的症状，尤其是在生育年龄尚未达到平均发病年龄51.23±7.33岁（男性51.23岁，女性51岁）的患者。
在本例中，III-2患者三十多岁，表明她可能远离平均发病年龄。然而，SCA36作为一种显性重复扩张疾病，其特征是遗传易感性，临床表现会在后代中出现得更早，或更严重。显性重复扩张疾病在重复扩张大小与发病年龄和病情严重程度之间存在明确的相关性，重复扩张越大，发病年龄越早，病情越严重。与II-2的418次重复相比，III-2的499次重复更高，这可能意味着III-2的发病会更早，病情更严重。为了防止该疾病遗传给她的孩子并加重病情，在辅助生殖技术中应用PGT-M是高度必要的。
但是，为了避免非靶向效应，尤其是在病因不明的单基因遗传病方面，在辅助生殖技术中PGT-M的标准是严格的。以SCA36为例，只有当重复扩张超过650时，PGT-M才被允许。然而，在上述案例中，II-2（具有典型表现）和III-2都低于该范围。因此，该研究建议更理性地扩展定义的致病区间，以提高PGT-M在临床的应用价值。
SCA36具有NOP56基因内GGCCTG六核苷酸重复序列的杂合性扩增，导致高GC含量和极长的重复序列，传统的检测方法受到限制。在本研究中，患者最初采用毛细管电泳结合实时定量 PCR 和 Southern 印迹技术检测 GGCCTG 重复扩增，但未能获得具体的重复序列信息。
事实上，短读长测序在准确地检测复杂长重复序列方面具有一定的局限性，人类基因组中微卫星重复序列的重复性和丰富性对全基因组研究构成了重大挑战。
近年来，长片段测序技术已在临床实践中出现，以更精确地检测串联重复扩张。长片段测序技术可以获得超过15kb，有时甚至高达2 Mb的读长，从而能够检测个体中的数千种结构变异，包括重复区域。长片段测序技术凭借其长的读长、高准确性和低GC偏好，让重复序列检测更加准确，从而有助于确定重复扩增是否在重新校准的致病范围之内。
NOP56基因LRS靶向捕获测序
DNA 投入量：3 μg
片段化长度：8~9 Kb
定制化Gene Panel: Repeat Expansion Diseases相关Gene Panel
测序平台：Pacific Biosciences Sequel IIe
参考资料
1.Liu F. A Novel Methodology to Recalibrate Pathogenic Range of SCA36 Repeat Expansions for PGT-M[J]. medRxiv, 2024: 2024.08. 11.24311662.
2. Ashizawa T, Öz G, Paulson HL. Spinocerebellar ataxias: prospects and challenges for therapy development [published correction appears in Nat Rev Neurol. 2018 Dec;14(12):749. doi: 10.1038/s41582-018-0102-z]. Nat Rev Neurol. 2018;14(10):590-605. doi:10.1038/s41582-018-0051-6