Genome Res. | 低温、线性扩增、侧翼捕获，大规模、高保真靶向分析微卫星图谱
- boke
- 2024-08-20
- 3:49 下午
微卫星(Microsatellites)又称短串联重复序列，是由短序列（1到6个碱基对）串联重复组成的基因组序列。微卫星位点在人类基因组中有100多万个微卫星位点。微卫星的重复结构使它们与其他基因组序列相比，突变率很高，可作为群体中个体或细胞间关系的标记。微卫星位点可用于各种应用领域，如血统追踪、群体遗传学、生态学和法医学。
微卫星因其重复结构在体内高度可变，且作为谱系标记物十分有用，但这一特性也有其弊端：微卫星在体外实验中产生的人工假象频率高于其他基因组元件，这可能导致基因分型不准确。
尽管存在这种“滞后”现象，但毛细管电泳仍能准确分析扩增的微卫星，因为代表真实基因型的最高信号峰可以与信号较低的相邻“滞后”峰区分开来。然而，毛细管电泳的通量仅限于少量位点和样本。
高通量测序比毛细管测序能测绘更多的微卫星位点，但测序必须有足够的读取深度全面覆盖不同区域的微卫星位点，同时，因为只有一部分读段能够完全跨越每个微卫星，这也需要进一步提高深度，导致了成本的增加。
通过PCR-free方法，可以减轻伪影和准确基因分型所需的读深度的影响。然而，在某些应用如单细胞DNA测序和法医学中，可用的DNA量较少，必须进行扩增。尽管高深度的全基因组测序（WGS）对PCR扩增的文库可以实现大规模、高保真的微卫星分析，但这难以扩展到推广到大规模样本和不同场景的应用中。
最近，研究人员开发了一套集成的生信分析和新型分子技术方法[1]，通过靶向捕获技术，可以对超过15万个微卫星位点进行分析测绘—实现了经济、准确的大规模微卫星图谱分析。这些工具可能为微卫星的新应用提供支持，并应用于广泛的生物学问题研究中。
首先，研究人员开发了一个微卫星位点筛选程序-STRATIFY，用于挑选各项参数适合的微卫星位点，包括GC含量，便于比对性、与其他位点的距离等。
探索不同探针设计对微卫星位点捕获的性能差异。微卫星位点的长度可变，跨越微卫星序列并延伸至其侧翼的探针无法有效工作。研究者测试了三种策略探针策略，1）单探针单侧侧翼覆盖；2）双探针双侧侧翼覆盖；3）单探针双侧侧翼覆盖。然后按照三种策略对3333个经STRATIFY筛选的微卫星位点设计并合成探针，再使用NA12877样本进行三重复捕获。
分析结果显示，策略2仅有0.005%的位点未覆盖，而1和3策略分别有1.2%和7.3%未覆盖，双探针双侧翼覆盖还是略优于单探针单侧翼覆盖。在跨位点Read的占比（可用于分析的有效Reads）方面，策略3的有效Reads占比更高，接近了75%，优于策略1和2，表明策略3的探针设计确实能更多的捕获跨微卫星位点Reads。此外，在富含AT序列丢失以及覆盖均一性Fold80方面，策略2也是最优。因此，策略2这种双探针双侧翼覆盖设计具有最优的覆盖率、覆盖均一性和数据有效性。
为解决微卫星图谱分析中最大的挑战—“停滞”伪影—该研究通过低温和线性扩增技术，显著减少了这些伪影。
此外，他们开发了一种分析工具，用于对生成的微卫星测序数据进行精确的基因分型，该工具采用了一种集成方法，整合了三种微卫星基因分型工具，并通过分析人类家系样本中的de novo微卫星突变进行了优化。
总的来说，该研究开发的一整套实验和分析工具，可对微卫星图谱进行高保真、大规模的剖析。
参考文献
1. Tsimikas S. Lipoprotein(a) in the Year 2024: A Look Back and a Look Ahead. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2024 Jul;44(7):1485-1490.
2. Anurag M , Michael D. S .Apolipoproteins in vascular biology and atherosclerotic disease[J].Nature reviews. Cardiology, 2022(3):19.
3. Tsimikas S, Bittner V. Particle Number and Characteristics of Lipoprotein(a), LDL, and apoB: Perspectives on Contributions to ASCVD. J Am Coll Cardiol. 2024 Jan 23;83(3):396-400.
4. Lipoprotein(a). Contemporary Cardiology. Kostner K, Kostner GM, Toth PP, eds. Humana press; 2023:1–443.
5. Nicholls S J , Nissen S E ,Fleming C.Urva S.Suico J.Berg P.H.Linnebjerg H.Ruotolo G.Turner P.K.Michael L.F.Muvalaplin, an Oral Small Molecule Inhibitor of Lipoprotein(a) Formation: A Randomized Clinical Trial[J].JAMA: the Journal of the American Medical Association, 2023, 330(11):1042-1053.
6. Michael S , Bittner V A , Philip A ,et al.Lipoprotein(a) lowering by alirocumab reduces the total burden of cardiovascular events independent of low-density lipoprotein cholesterol lowering: ODYSSEY OUTCOMES trial[J].European Heart Journal, 2020(44):44.
7. Tsimikas S, Fazio S, Ferdinand KC, Ginsberg HN, Koschinsky ML, Marcovina SM, Moriarty PM, Rader DJ, Remaley AT, Reyes-Soffer G, et al. NHLBI Working Group recommendations to reduce lipoprotein(a)- mediated risk of cardiovascular disease and aortic stenosis. J Am Coll Cardiol. 2018;71:177–192.