高度兼容 | 伯科WES靶向转录组测序
- boke
- 2022-08-15
- 7:21 上午
个体化癌症疫苗的开发需要通过比较来自患者肿瘤和正常组织（比如白细胞）的NGS测序数据（基因组外显子测序和转录组测序）来识别肿瘤特异的蛋白质编码基因的非同义突变，但并不是每个突变都会引起免疫反应。
临床研究中研究最多的突变类型是编码区的单核苷酸变异(SNV)。未来的一个重要领域是新抗原发现工具的开发，这些新抗原是由癌症特异性INDELs、融合基因和剪接变异体产生的，这些新抗原与自身抗原的相似性低于SNV衍生的新抗原。
图1 肿瘤患者个体化突变信息获取
由于内含子区域通常较大，又常含有重复序列，因此，在基因组层面检测融合基因的性价比可能不高。基因融合和可变剪接事件检测在转录组测序中更容易处理，因此，转录组测序除了进一步确认基因组变异和基因表达量信息外，还可以用于基因融合和可变剪接事件检测。
对于转录组测序，mRNA-Seq（PolyA）和去核糖体RNA-Seq（Ribo-Zero）在处理临床样本中存在一定的局限性，mRNA-Seq流程较为简单，但其性能表现严重依赖样本质量，对于降解严重的RNA样本，其基因覆盖会受到明显影响；虽然Ribo-Zero对基因的覆盖均一性优于mRNA-Seq，但Ribo-Zero去核糖体效率与样本质量有关，同时还存在RNA前体干扰（Intron），其有效数据占比（Exon）往往较低，同时会因为样本质量出现波动，影响实验流程的稳定性（图2）。
图2 mRNA-Seq和Ribo-Zero方法对不同类型、质量样本的测序表现[2]
转录组靶向捕获测序（RNA-Cap）不但耐受不同质量RNA样本，同时具有优异的基因覆盖均一性，是一种更加稳定、经济的转录组检测方法[3-6]。伯科全外显子芯片（Core Exome Panel v3.0）由120nt长链DNA探针组成，针对基因组序列设计，由于具有优异的GC和长度耐受能力，Core Exome Panel v3.0其对转录本序列同样具有良好的富集效果（图3）。
图3 Core Exome Panel v3.0探针设计示意图
利用肿瘤野生型和融合标准品样本（RIN：7.99/2.88），我们初步测试了伯科全外显子芯片（WES Cap）对于RNA样本的靶向捕获和融合基因检测表现。如图4所示，Total RNA-Seq和WES Cap分别测序108/115Gb和6.2Gb，按照WES Bed区间进行统计，Total RNA-Seq和WES Cap去Duplication后的测序深度分别为60.6x/72.1x和109-110x；覆盖率方面，由于针对基因组序列设计探针，WES Cap略低于Total RNA-Seq 2-4%；与Total RNA-Seq相比，WES Cap的On-Target（Reads）为93-96%，富集18-34倍，富集效率与先前RNA-Cap的报道一致[7]，Gene Panel的目标基因越多，其富集效率越低。
此外，WES Cap的Exonic占比为72.9-76.3%，呈现经典靶向富集表现。在转录本覆盖均一性上，WES Cap与Total RNA-Seq相似，无明显偏好。
图4 Core Exome Panel v3.0 RNA-Cap与Total RNA-Seq基本表现比较
在融合基因检测性能上，WES Cap在6.2Gb测序数据量，平均深度为~110x的条件下，可以稳定地检出6种融合基因变异。
表1 融合基因检测情况；* 融合基因表达的qPCR检测结果（GW-OPSM001，LOT#202106001）
