长文 | 系统盘点9种商业化实体瘤MRD技术
- boke
- 2022-09-13
- 7:21 上午
用于检测微小残留病灶(Minimal Residual Disease， MRD)的商业化液体活检技术正在迅速发展。循环肿瘤DNA（ctDNA）是细胞游离DNA（cfDNA）中的肿瘤来源成分，目前已成为癌症患者的一项重要的诊断型测试。一些旨在检测ctDNA的商业平台已被批准用于指导晚期实体瘤的临床决策，MRD检测可以监控预测肿瘤复发和转移。
目前，临床应用主要限于对晚期疾病患者样本进行分析，以确定可靶向治疗的突变。这些方法在检测非转移性疾病治愈性治疗后的MRD方面效果仍然有限。本文讨论了用于实体瘤ctDNA-MRD检测的商业液体活检平台的开发和临床应用。
美国FDA批准的第一个液体活检技术是单基因PCR检测，它检测血浆中的cfDNA，以发现晚期癌症患者的特定基因突变。其中Roche的cobas®突变检测产品于2016年6月获批用于辅助诊断。Qiagen therascreen® PIK3CA RGQ PCR试剂盒于2019年5月被批准用于晚期、HR阳性/HER2阴性乳腺癌患者的临床辅助诊断。
然而，基于PCR的单病灶检测仅限于检测个别基因的变异，而且检测极限通常高于0.5%（VAF），这限制了在MRD条件下检测ctDNA的能力。由于临床共识的基本技术标准是可稳定检测出低至≥0.02%的ctDNA，因此检测ctDNA的MRD需要明显提高检测低VAF的灵敏度。此外，ctDNA-MRD检测通常检测多个变异，以尽量减少采样误差并提高检测血浆中ctDNA的可能性。
与早期癌症检测相比，基于panel的NGS测序为肿瘤MRD检测开辟了两大技术路径：一是tumor-naïve，期望在不借助任何来自肿瘤组织信息的情况下，采用UMI、加深测序深度、算法等方法来提高固定化panel血液检测的灵敏度；另一个Tumor-informed是基于原发肿瘤组织的变异信息定制化设计panel进行MRD监控。
每种策略都各具优势，许多公司目前正在采用这些技术来设计ctDNA-MRD检测方法。一些观察性研究聚焦于ctDNA-MRD检测与不同肿瘤预后恶化之间的关联，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和膀胱癌。此外，一些前瞻性的随机试验正在利用ctDNA-MRD检测来指导干预治疗。本文概述用于检测ctDNA-MRD的商业平台和几种可用于临床（表1）或研究（表2）的ctDNA-MRD检测商业平台，重点介绍了技术差异和临床试验。最后，研究者从临床角度讨论了MRD检测的重要性，以及该领域未来的发展方向，这将促进ctDNA液体活检的临床实践。
从研究与开发到临床实践
实践中确定了验证检测效能所需的三类证据：分析有效性、临床有效性和临床效用。分析有效性是指一种检测方法可否准确可靠地测量所关注的目标位点或基因型（如ctDNA），由敏感性、特异性、可重复性和稳健性决定。临床有效性反映了与临床上有意义的事件（如疾病复发）相关的强度，由敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值决定。最后，临床实用性表现为一种检测方法能够为治疗提供信息并影响患者的长期结果（例如，由ctDNA MRD指导的辅助治疗能够改善生存率），这一点由前瞻性的随机试验决定。
检测方法开发的后续阶段涉及获得监管部门的许可并进入常规临床实践应用中。这些都依赖于对特定适应症的分析和临床有效性的验证。因此，能否提高无进展生存期（DFS）可以作为临床有效性的简单标准，这取决于辅助治疗的效果。由于MRD检测没有通用的标准，临床医生还必须仔细考虑其他因素，这些变量可能会影响方案的选择。一个因素是成本，纳入政府医疗保险将有利于提高报销周转效率。另一个因素是检测的周期，检测结果应在合理的时间内反馈，以避免延误辅助治疗。
表1 临床可用的MRD检测平台
可用于临床的商业平台
Signatera™ (Natera, Inc., San Carlos, CA, USA)
Signatera™是一种tumor-informed MRD检测，利用患者特异性肿瘤突变进行多重PCR扩增，随后对血浆中的cfDNA进行NGS检测。首先利用配对的全血测序选择来自原发肿瘤组织WES的前16个somatic突变（SNVs或indels），以过滤掉种系变异和克隆造血突变。根据克隆性、可检测性和突变频率来确定体细胞变异的优先次序。针对前16个肿瘤突变中的每一个设计引物，然后对在MRD情况下明确治疗后收集的后续血样中分离出的血浆cfDNA进行16-plex PCR。
这种方法可以对每个位点进行超深度测序，平均深度为100,000×，并减少非肿瘤变体的背景噪音。Signatera™已被证明能在16个位点中检测到每个样本至少两个肿瘤变异，在ctDNA浓度为0.01%-0.02%时，分析灵敏度超过98%。这个0.01%VAF的检测极限相当于在20,000个正常单倍体背景中检测出2个突变。
图1 前瞻性随机试验IMvigor011试验利用Signatera™检测ctDNA，然后将MRD阳性的患者随机分配到安慰剂组或辅助阿替唑单抗的干预组，以此证明ctDNA-MRD检测的临床效用
由于变异检测仅限于源自原发肿瘤样本的位点，tumor-informed检测可能会错失MRD环境中出现的克隆变异。为此Natera公司正在开发一个扩展的WES平台，可以检测血浆cfDNA中的大约2万个基因，这可能会更好地检测新的抗性突变。Signatera™的另一个局限性是，对肿瘤测序的依赖可能会延长整体的周转时间。
Signatera™已经获得了三个突破性设备的指定，一个在2019年5月，两个在2021年3月，并作为三个不同临床适应症的辅助诊断设备获得批准。2020年9月，Medicare敲定了一项计划，批准对II期和III期结直肠癌（CRC）患者使用Signatera™进行全覆盖，为手术后的辅助治疗提供依据，并监测复发。收到肿瘤组织标本后，肿瘤测序结果的周转时间约为两周，然后再花一周时间设计病人专用的PCR探针。一旦设计出患者专用的检测panel，基于治疗后血样的后续Signatera™检测结果可在一到两周内获得。
Signatera™已在多个实体肿瘤类型的前瞻性多中心队列研究中显示了临床有效性，包括CRC、NSCLC、乳腺癌和膀胱癌。对于接受手术治疗的I-III期NSCLC患者，Signatera™检测法被应用于TRACERx研究（NCT01888601）中24名患者的手术前和手术后血浆样本，。在14名最终复发的患者中，有13人在临床复发前或复发时ctDNA检测呈阳性（93%的敏感性）。ctDNA检测结果早于影像学证据2.3个月报出阳性。在10名没有复发临床证据的患者中，只有一名患者的ctDNA检测为阳性（90%的特异性）。
有趣的是，这个所谓的假阳性结果的患者同时接受了辅助化疗和放疗，这很可能消减了他们的ctDNA-MRD。总体来看，这些结果证明了使用Signatera™监测局部NSCLC患者的治疗反应和耐药性的潜力。
在一项研究中，Signatera™测定也取得了可喜的成果，该研究对49名I-III期乳腺癌高危患者进行了手术和辅助化疗后三年内跟踪研究。Signatera™的连续血浆分析预测了18例复发中的16例（89%），没有假阳性，与临床检测到的复发相比，中位领先时间为8.9个月（区间：0.5-24.0个月）。
在多中心I-SPY 2试验（NCT01042379）中，对84名II-III期乳腺癌高危患者使用Signatera™测量的ctDNA进行了单独研究，在73%的患者中检测到ctDNA治疗前。在完成新辅助化疗后，60名ctDNA预处理阳性的患者中，有17名取得了病理完全反应（pCR），同时ctDNA-MRD为阴性。在新辅助化疗后未获得pCR的43名患者中，14%的患者为ctDNA-MRD一致阳性，其转移性复发的风险明显降低（HR=10.4；95%CI：2.3-46.6）。
有趣的是，其余86%没有获得pCR的患者在新辅助化疗后被发现为ctDNA-MRD阴性，并具有与获得pCR的患者相当的良好结果（HR = 1.4; 95% CI: 0.2-13.5）。这些结果表明，从治疗前到化疗后缺乏ctDNA清除与治疗反应差有关，并最终导致较高的转移性复发率，而ctDNA清除，即使在那些未能获得pCR的人中，也能预测生存率的提高。
在未选择的患者中，添加阿特唑单抗并没有使DFS（HR=0.89；95%CI：0.74-1.08）或OS（HR=0.85；95%CI：0.66-1.09）得到明显改善。为了评估辅助治疗阿特唑单抗是否能使选定的在第一周期第1天（C1D1）ctDNA-MRD阳性的患者受益，并检验C1D1和第三周期第1天（C3D1）血浆中的ctDNA-MRD是否与较差的DFS有关，使用Signatera™检测法分析了581名加入IMvigor010的患者的血浆样本。
在C1D1（术后11周的中位数），37%（214/581）的患者血浆中ctDNA-MRD呈阳性，与阴性的患者相比，其疾病复发风险增加（HR=6.3；95%CI：4.45-8.92；观察组患者的P＜0.0001）。然而，与观察组的ctDNA-MRD阳性患者相比，接受辅助性阿特唑单抗的患者的DFS（HR = 0.58；95% CI：0.43-0.79；p = 0.0024；中位DFS：5.9 vs 4.4个月）和OS（HR = 0.59；95% CI：0.41-0.86；中位OS：25.8 vs 15.8个月）都有所改善。
相比之下，在C1D1时ctDNA-MRD阴性的患者中，阿特唑单抗治疗没有观察到比观察更多的临床益处。同样在C3D1，38%（186/485）的患者ctDNA-MRD阳性，与阴性的患者相比，疾病复发的风险更高（HR=8.65；95%CI：5.67-13.18；观察组患者的P<0.0001）。本研究还额外评估了循环肿瘤DNA的动态变化。
作者观察到，与那些在C3D1时仍可检测到ctDNA的患者相比，阿特唑单抗组的患者在C1D1时可检测到ctDNA，但在C3D1时变得不可检测（99人中有18人；18%），其DFS更优（HR=0.26；95%CI：0.12-0.56；p=0.0014；中位DFS：未达到VS 5.7个月）。这些发现表明，术后ctDNA-MRD检测和清除可以为MIBC患者术后辅助免疫检查点抑制剂的使用提供参考。
DARE研究（NCT04567420）是一项II期、随机、多中心试验，正在招募约100名目前正在接受辅助内分泌治疗且Signatera™检测结果为阳性的II-III期、HR阳性/HER2阴性乳腺癌患者。这些ctDNA阳性的患者将被随机分配到继续接受标准的内分泌治疗或开始接受CDK4/6抑制剂palbociclib联合氟维司群的治疗，为期两年。Palbociclib以及其他CDK4/6抑制剂还没有被批准用于辅助治疗。
PALLAS试验（NCT02513394）显示，与单独的内分泌治疗相比，在内分泌治疗的基础上加用辅助性Palbociclib并不能改善DFS。然而，MonarchE试验（NCT03155997）将患者随机分配到Abemaciclib与内分泌治疗或单独的内分泌治疗中，其早期数据显示这两个研究组之间的DFS存在明显差异。
一个值得前瞻性验证的假设是，评估CDK4/6抑制剂的辅助治疗是否只对HR阳性/HER2阴性的乳腺癌患者中的一部分ctDNA MRD阳性患者有利。为此，DARE试验旨在确定ctDNA指导下的CDK4/6抑制剂辅助治疗是否会导致DFS的显著改善，使用Signatera™来识别那些ctDNA MRD阳性的患者。同样，LEADER研究（NCT03285412）是一项II期随机试验，根据Signatera™检测，ribociclib用于治疗ER阳性早期乳腺癌患者，这些患者的ctDNA-MRD呈阳性。
Guardant Reveal™ (Guardant Health, Inc., Redwood City, CA, USA)
Guardant Reveal™是一种Tumor-naïve肿瘤测序，可以帮助临床医生识别CRC治愈性切除术后的高风险复发患者，有可能为辅助化疗的需要提供依据。Guardant Reveal™利用外周血中的血浆，应用固定的500kb的基因panel来进行捕获测序。该测定利用专有的生物信息学软件同时检测甲基化和基因组变异，同时旨在过滤掉克隆造血的生物噪音，而不需要对配对的外周血单核细胞进行测序。
通过整合基因组和表观基因组特征，Guardant Reveal™能够检测早期CRC患者的ctDNA，灵敏度高达91%，检测极限为0.01%VAF，周转时间约为7天。用Guardant Reveal™进行的ctDNA-MRD检测可以在多个时间间隔内连续进行，包括手术后4至6周和9至11周，以提高敏感性，并告知临床医生可检测到MRD的高风险患者，以便进行辅助化疗。循环肿瘤DNA监测可在术后16-18周再次进行，以确定那些在辅助治疗后仍可能有顽固疾病的患者。
在美国，每年有超过15万名患者被诊断为CRC，大多数CRC被早期诊断（I-III期），部分原因是实施了预防性策略，如结肠镜筛查和粪便DNA检测。对IIB期以上的CRC进行治愈性手术切除加辅助化疗后，标准的护理监测包括检查、癌胚抗原蛋白血检监测、间隔性计算机断层扫描和监测结肠镜。尽管采取了这些干预措施，CRC的复发率仍高达30-40%，其中80%的复发发生在切除术后头两年。辅助化疗为高危结肠癌提供了明显的生存优势，从而提高了ctDNA-MRD检测的吸引力。Guardant Reveal™检测方法尚未获得美国FDA批准，但在商业上可用于CRC的临床诊断。
Guardant Reveal™在一项针对接受治愈性治疗的I-IV期CRC患者的前瞻性观察研究中，显示出了良好的性能。该研究共招募了133名患者，其中70名患者符合最终分析的标准，即要求在完成最终治疗后（手术或辅助治疗后一个月）提供具有足够数量和质量的cfDNA的血浆。17名患者在明确治疗后有可检测的ctDNA，其中15人复发，而53名ctDNA-MRD阴性的患者中有12人也出现了复发（敏感性=55.6%，特异性=95.4%）。将分析限制在随访一年以上的患者（n = 64），15名患者的ctDNA-MRD可检测到，且全部复发，而49名ctDNA-MRD不可检测的患者中有12名也复发了（灵敏度=55.6%，特异性=100%）。
最后，当把这些随访超过一年的患者中所有可用的监测抽血结果纳入其中时，检测复发的敏感性进一步增加到69%，29名复发患者中有20名携带可检测的治疗后ctDNA，同时保持100%的特异性。这些发现表明，使用Guardant Reveal™技术进行治疗后ctDNA分析可以检测出CRC患者的残留病灶。
GEMCAD 1402研究（NCT02340949）是一项来自西班牙20家医院的II期多中心试验，将180名高危局部晚期直肠癌患者随机分配到5-氟尿嘧啶、白果酸和奥沙利铂（mFOLFOX6）±阿弗利贝特的新辅助治疗（TNT）改良方案中，随后进行化疗和手术。利用Guardant Reveal™检测法（以前称为LUNAR-1），对72名患者的基线和手术前样本进行了分析。基线时，83%的患者有可检测的ctDNA，而TNT手术后（手术前）有15%。没有发现ctDNA状态（可检测与不可检测）与病理反应之间的关联。然而，手术前可检测到的ctDNA与系统性复发（HR=4；95%CI：1.0-16.2）和较差的OS（HR=23；95%CI：2.4-212）显著相关。这项研究强调了局部晚期直肠癌患者在TNT后检测到的ctDNA的预后潜力。
PEGASUS研究（NCT04259944）是一项正在进行的II期、多中心、前瞻性试验，正在评估使用ctDNA液体活检来指导140名具有微卫星可测性的高风险II期（T4N0）和III期CRC患者的手术后管理的可行性，利用Guardant Reveal™平台进行ctDNA检测。在这项研究中，患者在手术后2至4周内按ctDNA的MRD状态随机选择，以指导卡培他滨或卡培他滨/奥沙利铂（CAPOX）的辅助治疗。在辅助治疗后，对所有患者的MRD状态进行重新评估以指导后续治疗。在第二轮检测中，ctDNA-MRD呈阳性的患者接受5-氟尿嘧啶加亮丙瑞林加伊立替康（FOLFIRI）或CAPOX的升级治疗，为期六个月。
NavDx™ (Naveris, Inc., Natick, MA, USA)
NavDxTM是一种用于监测HPV+口咽鳞状细胞癌的商业检测方法。它是利用数字液滴PCR来量化血浆中的循环人乳头瘤病毒DNA（ctHPVDNA）。在放疗和治疗后监测期间可对纵向血浆样本进行监测，利用针对HPV16的E6和E7基因以及HPV18、31、33和35的E7基因内的扩增子的PCR引物来分析ctHPVDNA的清除情况。
NavDxTM在一项纵向试验中得到验证，该试验招募了115名接受治愈性化疗的非转移性HPV+口咽鳞状细胞癌患者。在这项研究中，在基线、治疗期间每周一次以及治疗后每次随访时都要采血。中位随访时间为23个月，87名患者在治疗后的所有时间点都检测不到ctHPVDNA，疾病复发的阴性预测值为100%。在治疗后任何时间点ctHPVDNA都呈阳性的28名患者中，有16名患者的ctHPVDNA测试连续两次呈阳性，其中15人经活检证实疾病复发，这表明在治疗后监测环境中具有潜在效用。
在另一项NavDxTM研究中，46名接受经口手术的患者在手术后但在开始辅助治疗前采集了样本。64%（7/11）的复发患者可检测到循环人乳头瘤病毒DNA，而没有复发的患者为29%（10/34），不过这种差异并不明显（P = 0.1）。然而，可检测到的ctHPVDNA与较差的2年无进展生存期（45% vs 84%；p = 0.04）和OS（80 vs 100%；p = 0.02）明显相关。因此，治疗后应用NavDxTM有可能为HPV+口咽鳞状细胞癌患者的预后提供信息。
表2 目前仅供科研使用的MRD检测平台
仅供研究使用的商业平台
AVENIO (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)
AVENIO ctDNA分析试剂盒代表了三种基于混合捕获的NGS检测组合（靶向试剂盒、扩展试剂盒和监测试剂盒），用于实体肿瘤研究。Surveillance Kit旨在纵向监测手术切除后的NSCLC或CRC患者的肿瘤突变负荷。通过对四毫升血浆中的cfDNA采用Tumor-naïve的方法进行检测，Surveillance Kit对代表NSCLC和CRC中反复突变区域的197个基因进行了分析，对所有类别的突变（如SNVs、indels、fusions和CNAs）实现了>99%的特异性和>99%的PPV，检测极限为0.1% VAF。
该平台正在进行临床实验，包括一项II期试验（NCT04585477）中，评估I-III期NSCLC患者在接受治愈性治疗后，在两个周期的辅助杜伐单抗后，ctDNA水平是否有变化，ctDNA MRD是否呈阳性。主要结果是检测ctDNA-MRD水平的下降，特别是在两个周期的杜伐单抗治疗后下降≥3倍。本研究将使用AVENIO ctDNA Surveillance Kit进行ctDNA分析，以评估MRD状态。
最近，AVENIO Surveillance Kit也被用来确定血浆或尿液中的ctDNA是否能检测出少转移性CRC患者的MRD。血浆和尿液样本是在治愈性手术前和新辅助化疗后，从24名少转移性CRC患者身上前瞻性地收集的。使用基于AVENIO检测的肿瘤不成熟血浆ctDNA分析，MRD检测的灵敏度为95%，特异性为100%。在接受新辅助化疗的71%的患者中，MRD检测的敏感性为94%。基于尿液的ctDNA分析，MRD检测的特异性仍然很高，为100%，但由于尿液中的ctDNA水平比血浆中的低11倍，敏感性下降到64%。进一步的ctDNA Tumor-informed分析显示，81%的ctDNA-MRD阳性患者可能受益于包括靶向系统治疗或免疫检查点抑制剂在内的辅助治疗。需要进行更多的研究来验证这些发现，并确定它们是否能在未来指导寡转移性CRC的治疗决策。
最后，AVENIO检测将被用于一项III期临床试验（NCT04585490），用于对治愈性化疗后可检测到ctDNA-MRD的不可切除的III期NSCLC患者进行巩固治疗的个性化升级。这项研究的主要目的是测试通过将标准治疗（durvalumab）与额外的化疗相结合是否可以降低血液中可检测到的ctDNA水平。这项前瞻性研究有助于验证Moding等人发表的的研究结果，即化疗后局部晚期NSCLC的ctDNA-MRD对指导巩固性系统治疗有潜在的预测作用。
PCM™ (ArcherDX, Inc., Boulder, CO, USA)
由ArcherDX开发的个性化癌症监测（PCM™）技术，应用该公司专有的微创锚定多重PCR技术，通过Tumor-informed方式检测早期癌症患者的ctDNA-MRD。ArcherDX的PCM™平台的开发得到了TRACERx研究的支持，该检测方法在2020年1月获得了美国食品和药物管理局的突破性设备认定。在与阿斯利康的合作中，ArcherDX正在利用PCM™对NSCLC切除的肿瘤样本进行WES，并生成患者特定的ctDNA检测结果，然后在MERMAID-1研究（NCT04385368）中作为阿斯利康相关疗法的辅助诊断方法。
该研究是一项III期、随机、多中心、双盲、安慰剂对照研究，旨在研究在332名II-III期NSCLC患者中，在手术治疗后ctDNA MRD阳性的情况下，用杜伐单抗辅助免疫治疗与安慰剂相比的疗效。同样，MERMAID-II研究（NCT04642469）是一项III期、随机、双盲、安慰剂对照试验，旨在评估辅助性杜伐单抗与安慰剂在治愈性治疗（即完全手术切除，无论有无化疗）后无证据显示疾病复发但在96周监测期内ctDNA阳性的II-III期NSCLC患者中的疗效和安全性。这些研究有望为临床医生提供更多的工具来识别MRD并加强对ctDNA-MRD阳性的局部晚期NSCLC患者的治疗。它们还可以帮助指导临床医生避免对手术和辅助化疗后ctDNA-MRD阴性的患者进行额外的治疗。
在前面描述的TRACERx研究中，Abbosh等人还评估了使用PCM™监测ctDNA作为手术切除肿瘤后的辅助生物标志物的作用。在78名I-III期NSCLC患者中，生成了患者特定的多重PCR panel，并对608份血浆样本进行了分析。
ctDNA panel针对的是原发肿瘤组织中检测到的196个（区间：72-482）克隆和亚克隆变异。在VAF较低的情况下，对背景测序误差进行了估计和计算，以最大限度地提高ctDNA的检测率。50个变异的多重PCR-MRD检测在0.008%的VAF下显示出89%的敏感性（输入25纳克DNA），具有100%的实验特异性和99.9%的生信分析特异性（95%CI：99.67-99.99）。在45名出现疾病复发的患者中，有37名（82%）检测到了ctDNA-MRD，从ctDNA检测到临床复发的中位时间为151天（区间：0-984天），从手术到复发的时间为413天（区间：41-1242天）。
RaDaR™ (Inivata, Research Triangle Park, NC, USA and Cambridge, UK; Liquid Biopsy Division of NeoGenomics, Inc.)
RaDaR™是一种基于Inivata公司InVision®平台技术的Tumor-informed多重PCR的NGS测序。RaDaR™旨在追踪48个病人特定的变异，用于检测多种肿瘤类型的MRD，可用于治愈性治疗后或复发的早期检测。RaDaR™于2021年3月获得美国食品和药物管理局的突破性设备认定。Inivata公司报告说，RaDaR™的灵敏度为百万分之十，VAF检测限为0.001%，从样本采集到报告的反馈时间约为七天。
Inivata在2021年美国癌症研究协会年会上展示了两项研究，包括乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌的数据。在一项回顾性、多中心、原则性证明的研究中，22名非转移性乳腺癌患者在治愈性手术切除后被跟踪调查。从肿瘤切除后的147个血浆样本中提取cfDNA，用RaDaRTM测定法进行测序，以确定ctDNA及其与复发的关系。RaDaR™确定了所有复发患者的手术后ctDNA（n = 17；VAF区间：0.0007%-1.3%）。
此外，RaDaR™检测出的复发病例中，有5例没有被单基因数字液滴PCR检测出来。手术后检测到ctDNA与复发率明显升高有关（HR=6.9；95%CI：2.5-19.2），从检测到ctDNA到临床复发的中位时间为8.8个月。没有复发的五名患者的ctDNA为阴性。这些发现表明，用RaDaR™检测法检测手术后的ctDNA与非转移性乳腺癌治疗后的高复发风险有关。
RaDaR™还被用于LIONESS研究（Liquid BIOpsy for MiNimal RESidual DiSease Detection）。这项研究是一项前瞻性的、单中心的、产生证据的队列研究，调查了11名p16阴性头颈部鳞状细胞癌患者在治愈性手术切除后的ctDNA状态。在手术前采集的血浆样本中，基线ctDNA的VAF水平在0.014%至0.97%之间。在手术后的样本中，可以检测到ctDNA的水平低至0.0006% VAF。
对系列血浆样本的纵向监测显示，在四名复发的患者中，ctDNA的检测时间早于临床进展，提前时间为108至248天。虽然这项小型研究的结果是初步的，但它们表明ctDNA可以作为一种生物标志物，用于监测手术后的HPV阴性头颈部鳞状细胞癌。
PredicineALERT™（Predicine, Inc., Hayward, CA, USA）
PredicineALERT™是一个用于ctDNA MRD检测的平台，它使用现有的组织或体液样本（即血浆）来建立基线。PredicineWES是一种20,000个基因的panel测序，对编码区进行排序，覆盖深度为2500倍，检测极限为1%的VAF。PredicineATLAS是一种基于600个基因的混合捕获NGS检测，覆盖深度为20,000倍，检测极限为0.25% VAF。在使用PredicineWES和PredicineATLAS进行基线分析后，PredicineALERT™可实现个性化的Tumor-informed ctDNA监测，VAF水平低至0.005%，检测周期为7-10天。
该平台检测基因组变异的能力与PredicineCARE相当，后者是利用mCRPC患者的血浆cfDNA检测PTEN-PI3K-AKT和AR途径中的CNAs开发的检测方法。该公司已提交数据，根据基线分析确定的32个突变，追踪转移性耐阉割前列腺癌患者血浆中的ctDNA。然后，该检测方法被应用于检测在正常血浆中稀释到0.1%至0.005%浓度的ctDNA。该监测在0.005%的VAF时达到检测极限，平均检测到3.75个突变，灵敏度为100%，从而支持其分析有效性。该公司还报告说，该检测可以在没有基线样本的情况下达到0.025% VAF的检测极限。其临床有效性试验正在进行中。
MRDetect (C2i Genomics, New York, NY , USA)
MRDetect是C2i Genomics公司开发的一种基于WGS的MRD检测的Tumor-informed检测方法。该公司声称，MRD环境中ctDNA含量极低，仍然是深度靶向测序的主要障碍。他们证明，即使测序深度~40,000×并进行生物信息学纠错，突变检测也大多限于0.1%的VAF。这种检测极限似乎取决于可用的cfDNA分子的数量，一般来说，cfDNA分子的数量会随着癌症分期而减少，并且观察到检测到的突变数量与测序的独特cfDNA分子的数量之间存在正相关关系。
因此，C2i Genomics称，在疾病负担较轻的情况下，要克服有限的cfDNA输入所带来的这种基本限制，需要采取优先增加测序广度而不是深度的策略。为此MRDetect将WGS应用于肿瘤组织和来自匹配的外周血单核细胞的生殖系DNA，为每个个性化的ctDNA测定提供信息。然后，在cfDNA中检测每个SNV，以计算来自血浆样本的累积全基因组肿瘤信号。同样，CNAs从肿瘤测序中获取，并在血浆cfDNA中检测，与SNV数据相结合，生成一个统计检测分数。这样一来，MRDetect利用来自数千个体细胞突变的信号，使检测极限小于每一个总的单倍体基因组当量的一个。这在概念上类似于CAPP-Seq的开发者使用二项式概率分布的数学建模结果，证明了多突变可以实现超低ctDNA检测极限的能力。
通过整合来自全基因组突变的信号，随后使用基于机器学习的过滤策略来减少噪音，MRDetect被证明可以实现高度敏感的ctDNA检测，肿瘤分数低至0.001%，全基因组测序深度为35倍，只需要两到三毫升全血（~1毫升血浆）。通过结合8名不同类型的癌症患者（如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和骨肉瘤）的肿瘤和匹配的生殖系WGS数据，用700个不同肿瘤成分的掺入位点模拟ctDNA检测，验证了这一点，区间从0.001%到20%。使用MRDetect的基于SNV和基于CNA的检测组合也被应用于从19名CRC患者和22名肺腺癌患者的单独队列中收集的术后血浆。
在CRC患者中，ctDNA-MRD检测阳性（n = 7）与阴性（n = 12）相比，DFS明显缩短（p = 0.03）。同样，在肺腺癌患者中，ctDNA MRD检测阳性（n = 10）与阴性（n = 12）相比，DFS明显缩短（p = 0.009）。
肿瘤测序的全基因组覆盖加强了检测克隆变异的能力，这些变异可能因为二次抽样而被panel所遗漏。此外，在全基因组区间内整合SNVs和CNAs可能会提高检测肿瘤类型中ctDNA-MRD的敏感度，无论它们主要是由高突变负荷还是由非整倍体驱动。MRDetect提供了一种独特的ctDNA-MRD检测方法，预计将在大型前瞻性队列中进一步研究利用这种技术。
PhasED-Seq (Foresight Diagnostics Inc., Aurora, CO, USA)
PhasED-Seq (Phased Variant Enrichment and Detection Sequencing)是一种Tumor-informed的混合捕获测序方法，利用检测分型变异（PVs），即在同一条DNA链上150个bp区域内发生的两个或多个变异，以实现高灵敏度的ctDNA检测。这是通过CAPP-Seq对基于SNV的双链测序的一种替代方法，它依赖于对两条亲本DNA链上互补的体细胞变异的检测来减少背景噪音。然而，双链测序受限于DNA双链的回收率，而双链往往只占ctDNA总量的一小部分，因此在MRD环境下是不理想的。通过专注于检测同一DNA分子（顺式）上的突变，而不是双链（反式）上的突变，PhasED-Seq能够实现更高的DNA回收效率，这是影响检测灵敏度的一个关键因素。
一项研究首次证明了PhasED-Seq作为检测光伏的方法的可行性，该研究利用来自24种癌症类型的2,538个肿瘤的WGS数据来识别反复出现PVs的基因组区域。研究发现，与其他癌症类型相比，这些区域在B细胞淋巴瘤（如弥漫性大B细胞淋巴瘤或DLBCL；滤泡性淋巴瘤）中更为富集，并与已知的突变特征相关（如B细胞淋巴瘤中的AID超突变；多种实体癌类型中的APOBEC3B）。在淋巴肿瘤中检测到的PV发生在与已知的高突变区域相对应的特定区域，如FL中的BCL2和Burkitt淋巴瘤中的MYC，而在其他实体瘤中PV存在于整个基因组中。
为了验证这种ctDNA检测方法，研究者将PhasED-Seq应用于淋巴瘤和实体瘤。根据DLBCL患者的WGS数据中发现的复发性PV，为淋巴瘤设计了一个靶向测序panel。这个PhasED-Seq panel检测DLBCL患者的16个治疗前肿瘤或血浆cfDNA样本。与之前建立的旨在使用双链测序检测B细胞淋巴瘤中的SNVs的panel相比，PhasEDSeq panel检测到的SNVs（中位数：304.5 vs 114）和PVs（中位数：2461 vs 423）的数量明显多于每个病人。
为了测试PhasED-Seq的分析灵敏度，使用来自淋巴瘤患者的ctDNA稀释到健康对照cfDNA中，模拟预期的肿瘤部分，区间从0.1%到0.00005%。PhasED-Seq的表现明显优于基于SNV的双链测序，其检测极限低于百万分之一。此外，PhasED-Seq应用于12个对照cfDNA样本，发现与双链测序相比，背景信号率明显更低，从而进一步提高了ctDNA的检测极限。
当PhasED-Seq应用于两个周期的标准免疫化疗后的88名DLBCL患者的ctDNA检测时，它在25%基于SNV测序判为阴性的样本中检测到ctDNA（即潜在的假阴性），ctDNA阴性定义为ctDNA减少2.5log，并显示在两个周期后具有预后性。在治疗结束后，在19名DLBCL患者中再次将PhasED-Seq与基于SNV的测序进行了比较。在治疗后最终复发的5名患者中，只有2人通过基于SNV的测序检测到ctDNA，而5人通过PhasED-Seq都检测到ctDNA。因此，证明了PhasED-Seq在DLBCL中检测ctDNA-MRD的灵敏度很高。
在将PhasED-Seq的应用扩展到实体瘤时，一般来说，实体瘤并不存在集中在特定基因组区域的PV，靶向测序需要使用WGS的Tumor-informed方法来识别个性化的PV数据集。作者通过WGS为6名实体瘤患者（5名肺癌患者和1名乳腺癌患者）设计个性化的panel来评估这种方法的效能。PhasED-Seq在6名患者收集的24个血浆样本中的15个样本中检测到了ctDNA，而基于SNV的测序检测到了9个。PhasED-Seq检测到的这6个额外样本中的肿瘤成分低至0.000094%（即低于百万分之一）。
在疾病复发时ctDNA重新出现之前，在治疗期间收集的三个样本中，基于SNV的测序未能检测到ctDNA的MRD，但PhasED-Seq在所有这三个样本中捕获了ctDNA的MRD，肿瘤比例低至0.00016%。这些结果表明，PhasED-Seq可以通过个性化的方法应用于实体瘤MRD监测。
未来的方向
对于实体瘤患者群体来说，用于ctDNA-MRD液体活检平台的快速发展为提高辅助治疗中肿瘤状态预判提供了可能。此外，它还可以提高辅助治疗的效能，让临床医生避免过度治疗，并为复发风险最高的患者保留额外治疗。
展未来，商业和学术伙伴正在努力推进流程的标准化（例如，样品的收集、储存和处理），以保持检测结果的高度一致性。商业检测的基本标准化包括对血浆的要求，因为从全血中分离细胞物质以分离出血浆的过程减少了干扰cfDNA分析的细胞DNA污染量。这里回顾的试验旨在推进ctDNA-MRD环境下的辅助治疗选择。商用MRD检测处于精准肿瘤学的前沿，将ctDNA-MRD检测纳入治疗模式的做法在整个实体瘤领域将继续快速发展。本综述中讨论的液体活检技术突出了目前肿瘤学领域的进步和进展情况，未来有可能通过ctDNA-MRD检测促进治疗的个性化并提高患者的生存率。
